Deteção de Heterodimerization de isoformas de proteínas usando um ensaio de ligadura de proximidade em Situ
Summary
Aqui, nós mostramos como usar uma proximidade da ligadura do ensaio (PLA) para visualizar MST1/MST2 heterodimerization em células fixas com alta sensibilidade.
Abstract
Interações da proteína-proteína regulamentados são um princípio orientador para muitos eventos de sinalização, e a detecção de tais eventos é um elemento importante na compreensão de como tais caminhos são organizados e como eles funcionam. Existem muitos métodos para detectar interações da proteína-proteína nas células, mas relativamente poucos podem ser usados para detectar interações entre proteínas endógenas. Um tal método, o ensaio de ligadura de proximidade (PLA), tem várias vantagens para recomendar seu uso. Em comparação com outros métodos comuns de análise de interação da proteína-proteína, PLA tem relativamente elevada sensibilidade e especificidade, pode ser realizada com manipulação mínima da célula e, no protocolo descrito neste documento, requer apenas dois alvos anticorpos derivados de espécies diferentes (por exemplo., rato e coelho) e um reagente especializado: um conjunto de anticorpos secundários que estão covalentemente ligadas ao específico oligonucleotides que, quando trouxe em estreita proximidade um do outro, criar um ampliáveis plataforma para em situ PCR ou amplificação de círculo rolante. Nesta apresentação, mostramos como aplicar a técnica PLA para visualizar alterações na proximidade MST1 e MST2 em células fixas. A técnica descrita neste manuscrito é particularmente aplicável para a análise de estudos de sinalização celular.
Introduction
Interrupção de sinalização MST1/Hippo tenha sido conectada para transtornos globais do desenvolvimento e carcinogênese1. Nos mamíferos, ativam as quinases MST1 e MST2 (fosforilar) MOB1 e LATS1/2, o último dos quais depois fosforila e inactivates ativador transcricional co Sim-associado a proteínas (YAP)2. Na sua forma ativa (unphosphorylated), YAP tem atividade oncogênica, realçando a transcrição de genes de proliferação celular; Inversamente, quando YAP é inativado por via de hipopótamo, é suprimida a proliferação celular e apoptose promovida3. Em tecidos, MST1 e MST2 existem principalmente como homodimers ativo, mas estímulos oncogênicos podem aumentar os níveis de MST1/MST2 heterodímeros, e tais heterodímeros são inativos4. No entanto, como heterodimerization MST1/MST2 é regulada continua a ser mal compreendido. Homo – e heterodímeros são mediadas através de interações entre regiões de bobina coiled do C-terminal do MST1 e MST2 conhecida como SARAH domínios5. Usando um em situ PLA demonstrado neste artigo, vamos mostrar a presença de MST1/MST2 heterodímeros nas células células de Schwann humanas (HSC) e rim embrionário humano (HEK-293). PLA tem uma vantagem sobre outros métodos de deteção de interação da proteína/proteína porque permite a detecção de interações proteína-proteína endógena, que pode ser identificado e quantificado sem a necessidade de expressão do transgene ou o uso do Tag do Resumo 6.
Sinalização de vias de transdução em grande parte são controladas pela Associação condicional de proteínas de componente. Por exemplo, estimulação da quinase de tirosina do receptor a maioria leva a sua homo ou hetero-dimerização e subsequente associação com proteínas de sinalização intracelulares adicionais, que eles mesmos formar mais complexos. O objetivo do método PLA é Visualizar a proximidade entre as proteínas nas células, desde que as proteínas são menos de 30-40 nm separados. Proximidade de proteína é geralmente detectada pelo primeiro incubar as células com anticorpos primários adequados levantados em diferentes espécies (EG., coelho e rato) contra cada proteína de interação, então a adição de anticorpos secundários espécie-específicos, sondas de DNA previamente acoplado à curta. Se as sondas de DNA estão nas proximidades, um oligonucleotide vinculação específica do DNA pode vincular simultaneamente tanto destas sondas, formando uma plataforma para a amplificação por em situ PCR ou por mecanismo de círculo de rolamento. Etiquetas fluorescentes adicionadas para a reação de amplificação permitem a visualização das proteínas de interação, que aparecem como pontos fluorescentes que podem ser facilmente quantificados e localizados em regiões específicas na célula7,8, 9 , 10.
Protocol
Representative Results
Discussion
Achamos útil usar lâminas de câmara para esta experiência, como é muito conveniente realizar o experimento com várias linhas de célula (14-16) e não há nenhuma necessidade de mudar a amostra de cada vez durante a análise de microscopia. Algumas complicações podem surgir, tais como um aumento do risco de contaminação cruzada com os anticorpos. Portanto, sugerimos lavar cada poço individualmente em vez de usar uma jarra de Coplin, apesar da maior duração do experimento. Além disso, a remoção da inserç?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos todo laboratório Chernoff para contribuir para a otimização e validação do presente protocolo, em particular Maria Radu e Galina Semenova. Agradecemos também Andrey Efimov da célula Imaging facilidade no Fox Chase Cancer Center. Este trabalho foi apoiado por uma concessão do NIH (R01 CA148805) para JC.
Materials
| Chamber slides | Thermo Fisher Scientific | 178599 | 16 well, glass slide |
| PLA probe Anti-Mouse Minus | Sigma-Aldrich | DUO92004 | Contains 1x Blocking solution, 1x antibody Diluent |
| PLA Probe Anti-Rabbit PLUS | Sigma-Aldrich | DUO92002 | Contains 1x Blocking solution, 1x antibody Diluent |
| Wash Buffers, Flurescence | Sigma-Aldrich | DUO82049 | Contains Wash Buffer A and Wash Buffer B |
| Mounting Medium with DAPI | Sigma-Aldrich | DUO82040 | |
| Detection Reagents Red | Sigma-Aldrich | DUO92008 | Contains 5x Ligation, 1x Ligase, 5x Amlification Red, 1x Polymerase |
| p44/42 MAPK (Erk1/2) Antibody | Cell Signaling | 9102s | |
| Phospho-p44/42 MAPK (Erk1) (Tyr204)/(Erk2) (Tyr187) | Cell Signaling | 5726s | pERK antibody |
| MST2 antibody | Cell Signaling | 3952s | |
| Krs-2 (RJ-5) | Santa Cruz | sc-100449 | MST1 antibody |
| 16% Paraformaldehyde | Electron microscopy sciences | 15710 | Dilute to 4% PFA in PBS for fixing solution |
| Triton x100 | Fisher BioReagents | BP 151-500 | To prepare 0.1% Triton x-100 in 1xPBS for Permeabilization solution |
| Confocal microscopy | Leica TCS SP8, 63x | Image analysis with ImageJ software |
References
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