Summary

Détection de hétérodimérisation des isoformes de protéines à l’aide d’un test in Situ proximité ligature

Published: October 20, 2018
doi:

Summary

Ici, nous montrons comment utiliser un test de ligature de proximité (PLA) pour visualiser MST1/MST2 hétérodimérisation dans les cellules fixes à haute sensibilité.

Abstract

Interactions de protéine-protéine réglementés sont un principe directeur pour de nombreux événements de signalisation, et la détection de tels événements est un élément important pour comprendre comment ces voies sont organisés et comment ils fonctionnent. Il existe de nombreuses méthodes pour détecter des interactions protéine-protéine dans les cellules, mais relativement peu peuvent être utilisés pour détecter des interactions entre protéines endogènes. Une de ces méthodes, le dosage de la ligature de proximité (PLA), présente plusieurs avantages pour recommander son utilisation. Par rapport aux autres méthodes courantes d’analyse des interactions protéine-protéine, PLA a la spécificité et la sensibilité relativement élevée, peut être réalisée avec manipulation cellule minimale et, dans le protocole décrit ci-après, nécessite seulement deux spécifique à la cible anticorps provenant de différentes espèces (p. ex.., de souris et le lapin) et un réactif spécialisé : un ensemble d’anticorps secondaires qui sont des oligonucléotides par covalence liés à certains qui, quand à proximité d’un autre, créer un amplifiable plate-forme pour in situ par PCR ou l’amplification de cercle roulant. Dans cette présentation, nous montrons comment appliquer la technique PLA pour visualiser les changements à proximité de MST1 et MST2 dans les cellules fixes. La technique décrite dans ce manuscrit est particulièrement adaptée pour l’analyse des études de signalisation cellulaire.

Introduction

Perturbation de la signalisation de MST1/Hippo a été liée à des troubles du développement et de la carcinogenèse1. Chez les mammifères, les kinases MST1 et MST2 activent (phosphoryler) MOB1 et LATS1/2, dont le dernier puis phosphoryle et inactive l’activateur de la transcription co Oui-associated protein (YAP)2. Sous sa forme active (lieu), YAP a activité oncogénique, améliorant la transcription des gènes de la prolifération cellulaire ; à l’inverse, lorsque YAP est inactivée par la voie de l’hippopotame, la prolifération cellulaire est supprimée et l’apoptose promu3. Dans les tissus, MST1 et MST2 existent principalement sous forme d’homodimères active, mais des stimuli oncogènes peuvent augmenter les niveaux de MST1/MST2 hétérodimères et telles hétérodimères sont inactifs4. Cependant, comment hétérodimérisation MST1/MST2 est réglementée reste mal comprise. Les deux homo – et hétérodimères sont médiée par les interactions entre régions coiled-coil C-terminales de MST1 et MST2 dite SARAH domaines5. En utilisant un in situ PLA démontré dans cet article, nous montrons la présence de MST1/MST2 hétérodimères dans les cellules de Schwann humaine (HSC) et rein embryonnaire humain cellules (HEK-293). PLA a un avantage sur les autres méthodes de détection d’interactions protéine/protéine parce qu’il permet la détection des interactions protéine-protéine endogène, qui peuvent être identifiés et quantifiés sans le besoin d’expression du transgène ou l’utilisation d’étiquettes d’épitope 6.

Signalisation des voies de transduction sont en grande partie contrôlés par l’association conditionnelle des protéines composant. Par exemple, stimulation de la plupart tyrosine kinase entraîne leur homo – ou hétéro-dimérisation et association subséquente avec d’autres protéines de signalisation intracellulaires, qui eux-mêmes formant des complexes plus. L’objectif de la méthode PLA est de visualiser un lien étroit entre les protéines dans les cellules, sous réserve que les protéines sont moins de 30-40 nm apart. Proximité de protéine est généralement détectée en premier en incubant les cellules avec des anticorps primaires appropriés chez les différentes espèces (p. ex.., lapin et souris) contre chaque protéine d’interaction, puis en ajoutant des anticorps secondaires propres à chaque espèce, des sondes d’ADN avant couplé à court. Si les sondes ADN sont à proximité, un oligonucléotide spécifique d’ADN liant pouvez lier simultanément deux de ces sondes, formant une plate-forme pour l’amplification par in situ par PCR ou par mécanisme de cercle de roulement. Étiquettes fluorescentes ajoutés à la réaction d’amplification permettent visualisation des protéines qui interagissent, qui apparaissent comme des points fluorescents qui peuvent être facilement quantifiés et localisés à des régions particulières dans la cellule7,,8, 9 , 10.

Protocol

1. préparation des Solutions Préparer la solution de fixation : 4 % de paraformaldéhyde (PFA) dans du PBS 1 x. Prendre 10 mL, 2,5 mL de 16 % PFA et ajouter 7,5 mL de PBS 1 x.Risques : PFA est cancérogène aux doses faibles. Fumées et contact avec la peau sont dangereux. Conserver à-20 ° C. Préparer la solution de la perméabilisation : 0,1 % Triton X-100 dans du PBS 1 x. Pour 100 mL de solution, ajouter 100 µL de Triton X-100 dans 100 mL de solution 1 PBS x. Conserver …

Representative Results

Nous avons utilisé le test PLA pour tester l’interaction entre MST1 et MST2 HEK-293 et iHSC. Les cellules ont été fixées, perméabilisées et colorées avec les anticorps différents, suivies en situ amplification selon le protocole PLA (Figure 1). Afin de documenter le niveau de hétérodimérisation de MST1/MST2, les cellules ont été colorées avec des anticorps MST1 ou MST2 (Figure 1 a, 1C et 1 G</stro…

Discussion

Nous avons trouvé utile d’utiliser des lames de verre chambre pour cette expérience, car il est très pratique réaliser l’expérience avec plusieurs lignées de cellules (14-16) et il n’y a pas besoin de changer l’échantillon chaque fois lors de l’analyse de la microscopie. Quelques complications peuvent survenir, comme une augmentation du risque de contamination croisée avec des anticorps. Par conséquent, nous suggérons de laver chaque cupule individuellement au lieu d’utiliser une coloration, malgré…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Nous remercions le laboratoire Chernoff ensemble pour contribuer à l’optimisation et la validation du présent protocole, notamment Maria Radu et Galina Semenova. Nous remercions également Andrey Efimov de l’installation d’imagerie cellulaire au Fox Chase Cancer Center. Ce travail a été soutenu par une subvention du NIH (R01 CA148805) de JC.

Materials

Chamber slides Thermo Fisher Scientific 178599 16 well, glass slide
PLA probe Anti-Mouse Minus Sigma-Aldrich DUO92004 Contains 1x Blocking solution, 1x antibody Diluent
PLA Probe Anti-Rabbit PLUS Sigma-Aldrich DUO92002 Contains 1x Blocking solution, 1x antibody Diluent
Wash Buffers, Flurescence Sigma-Aldrich DUO82049 Contains Wash Buffer A and Wash Buffer B
Mounting Medium with DAPI Sigma-Aldrich DUO82040
Detection Reagents Red Sigma-Aldrich DUO92008 Contains 5x Ligation, 1x Ligase, 5x Amlification Red, 1x Polymerase
p44/42 MAPK (Erk1/2) Antibody Cell Signaling 9102s
Phospho-p44/42 MAPK (Erk1) (Tyr204)/(Erk2) (Tyr187) Cell Signaling 5726s pERK antibody
MST2 antibody Cell Signaling 3952s
Krs-2 (RJ-5) Santa Cruz sc-100449 MST1 antibody
16% Paraformaldehyde Electron microscopy sciences 15710 Dilute to 4% PFA in PBS for fixing solution
Triton x100 Fisher BioReagents BP 151-500 To prepare 0.1% Triton x-100 in 1xPBS for Permeabilization solution
Confocal microscopy Leica TCS SP8, 63x Image analysis with ImageJ software

References

  1. Zhou, D., et al. The Nore1B/Mst1 complex restrains antigen receptor-induced proliferation of naïve T cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (51), 20321-20326 (2008).
  2. Praskova, M., Xia, F., Avruch, J. MOBKL1A/MOBKL1B phosphorylation by MST1 and MST2 inhibits cell proliferation. Current Biology. 18 (5), 311-321 (2008).
  3. Dan, I., Watanabe, N. M., Kusumi, A. The Ste20 group kinases as regulators of MAP kinase cascades. Trends in Cell Biology. 11 (5), 220-230 (2001).
  4. Rawat, S. J., et al. H-ras Inhibits the Hippo Pathway by Promoting Mst1/Mst2Heterodimerization. Current Biology. 26 (12), 1556-1563 (2016).
  5. Creasy, C. L., Ambrose, D. M., Chernoff, J. The Ste20-like protein kinase, Mst1, dimerizes and contains an inhibitory domain. Journal of Biological Chemistry. 271 (35), 21049-21053 (1996).
  6. Buntru, A., Trepte, P., Klockmeier, K., Schnoegl, S., Wanker, E. E. Current Approaches Toward Quantitative Mapping of the Interactome. Frontiers in Genetics. 74 (7), (2016).
  7. Greenwood, C., Ruff, D., Kirvell, S., Johnson, G., Dhillon, H. S., Bustin, S. A. Proximity assays for sensitive quantification of proteins. Biomolecular Detection and Quantification. 4, 10-16 (2015).
  8. Fredriksson, S., et al. Protein detection using proximity-dependent DNA ligation assays. Nature Biotechnology. 20 (5), 473-477 (2002).
  9. Leuchowius, K. J., et al. Parallel visualization of multiple protein complexes in individual cells in tumor tissue. Molecular & Cellular Proteomics. 12 (6), 1563-1571 (2013).
  10. Söderberg, O., et al. Direct observation of individual endogenous protein complexes in situ by proximity ligation. Nature Methods. 3 (12), 995-1000 (2006).

Play Video

Cite This Article
Karchugina, S., Chernoff, J. Detection of Heterodimerization of Protein Isoforms Using an in Situ Proximity Ligation Assay. J. Vis. Exp. (140), e57755, doi:10.3791/57755 (2018).

View Video