Summary

Detección de Heterodimerization de isoformas de la proteína usando un análisis de ligadura in Situ proximidad

Published: October 20, 2018
doi:

Summary

Aquí, mostramos cómo hacer un análisis de proximidad de la ligadura (PLA) visualizar heterodimerization MST1/MST2 en células fijas con alta sensibilidad.

Abstract

Las interacciones proteína-proteína regulada están un principio rector de muchos eventos de señalización, y la detección de este tipo de eventos es un elemento importante en la comprensión de cómo estas vías están organizadas y cómo funcionan. Hay muchos métodos para detectar las interacciones proteína-proteína en las células, pero relativamente pocos pueden utilizarse para detectar interacciones entre proteínas endógenas. Un tal método, el análisis de ligadura de proximidad (PLA), tiene varias ventajas para recomendar su uso. En comparación con otros métodos comunes de análisis de interacción de proteínas, PLA tiene relativamente alta sensibilidad y especificidad, se puede realizar con la manipulación mínima de la célula y en el protocolo descrito en este documento, requiere sólo dos específico del destino anticuerpos derivan de diferentes especies (por ejemplo., de ratón y conejo) y un reactivo especializado: un conjunto de anticuerpos secundarios que son oligonucleótidos covalentemente ligados a determinado que, cuando muy cerca uno del otro, crear un plataforma amplificable en situ PCR o amplificación de círculo rodante. En esta presentación mostramos cómo aplicar la técnica PLA para visualizar cambios en proximidad MST1 y MST2 en células fijas. La técnica descrita en este manuscrito es particularmente aplicable para el análisis de estudios de señalización de la célula.

Introduction

Interrupción de señalización MST1/Hippo ha estado ligada a trastornos del desarrollo y carcinogénesis1. En mamíferos, se activan las quinasas MST1 y MST2 (fosforilan) MOB1 y LATS1/2, el último de los cuales luego fosforila y hace inactivo el coactivador transcripcional de la proteína asociada a Yes (YAP)2. En su forma activa (unphosphorylated), YAP tiene actividad oncogénica, mejorar la transcripción de genes de proliferación celular; por el contrario, cuando YAP es inactivado por la vía de Hippo, se suprime la proliferación celular y apoptosis promovido3. En los tejidos, MST1 y MST2 existen principalmente como homodímeros activo, pero estímulos oncogénicos pueden aumentar los niveles de heterodímeros MST1/MST2 y son de estos heterodímeros inactivos4. Sin embargo, cómo está regulada la MST1/MST2 heterodimerization sigue siendo mal entendida. Homo – y heterodímeros están mediada a través de interacciones entre regiones de en espiral-arrolle c-terminal de MST1 y MST2, conocida como SARAH dominios5. Usando una en situ PLA demostrado en este artículo, nos muestran la presencia de heterodímeros MST1/MST2 en las células de las células de Schwann humana (HSC) y riñón embrionario humano (HEK-293). PLA tiene una ventaja sobre otros métodos de detección de interacción proteína/proteína, ya que permite la detección de interacciones proteína-proteína endógena, que puede ser identificado y cuantificado sin la necesidad de expresión del transgen o el uso de etiquetas del epítopo 6.

Vías de transducción de señalización son controladas en gran parte por la Asociación condicional de proteínas componentes. Por ejemplo, la estimulación de la mayoría del receptor tirosina quinasas conduce a su homo o hetero-dimerización y posterior asociación con proteínas de señalización intracelulares adicionales, que a su vez formar más complejos. El propósito del método PLA es visualizar la proximidad entre las proteínas en las células, siempre que las proteínas son menos de 30-40 nm aparte. Proximidad de proteína generalmente se detecta por primera incubar las células con anticuerpos primarios apropiados en diferentes especies (por ej., conejo y ratón) contra cada interacción proteína, luego agregar anticuerpos secundarios propios de cada especie, sondas de ADN previamente acoplado a corto. Si las sondas de ADN están en proximidad cercana, un oligonucleótido de ADN enlace específico al mismo tiempo puede enlazar tanto de estas sondas, formando una plataforma para la amplificación en situ PCR o mecanismo del círculo del balanceo. Etiquetas fluorescentes agregados a la reacción de amplificación permiten la visualización de las proteínas obran recíprocamente, que aparecen como puntos fluorescentes que pueden ser fácilmente cuantificados y localizadas en determinadas regiones en la celda7,8, 9 , 10.

Protocol

1. preparación de soluciones Preparar solución de fijación: 4% paraformaldehido (PFA) en PBS 1 x. Para 10 mL, tomar 2.5 mL de 16% PFA y agregar 7,5 mL de PBS 1 x.Peligros: PFA es carcinogénico a dosis bajas. Los vapores y el contacto con la piel son peligrosos. Almacenar a-20 ° C. Preparar solución de permeabilización: 0,1% Tritón X-100 en PBS 1 x. Para 100 mL de solución, añada 100 μl de Tritón X-100 en 100 mL de 1 x PBS. Almacenar a temperatura ambiente (RT). <…

Representative Results

Se utilizó el ensayo PLA para probar la interacción entre MST1 y MST2 en HEK-293 y iHSC. Las células eran fijos, permeabilized y teñidas con anticuerpos diferentes, seguidos de amplificación en situ según el protocolo PLA (figura 1). Para documentar el nivel de heterodimerization MST1/MST2, las células fueron teñidas con anticuerpos MST1 y MST2 (figura 1A, 1C y 1 G). Como control positivo, tambi?…

Discussion

Nos pareció útil portaobjetos de la cámara para este experimento, ya que es muy conveniente realizar el experimento con varias líneas de celulares (14-16) y no hay necesidad de cambiar la muestra cada vez que durante el análisis de microscopía. Pueden surgir algunas complicaciones, tales como un mayor riesgo de contaminación cruzada con los anticuerpos. Por lo tanto, sugerimos lavar cada pozo individual en lugar de utilizar un frasco de Coplin, a pesar de la mayor duración del experimento. Además, la remoción d…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Agradecemos al laboratorio de Chernoff todo para contribuir a la optimización y validación de este protocolo, en particular María Radu y Galina Semenova. También agradecemos a Andrey Efimov de la instalación de la proyección de imagen de celular en el Fox Chase Cancer Center. Este trabajo fue financiado por una subvención del NIH (R01 CA148805) a JC.

Materials

Chamber slides Thermo Fisher Scientific 178599 16 well, glass slide
PLA probe Anti-Mouse Minus Sigma-Aldrich DUO92004 Contains 1x Blocking solution, 1x antibody Diluent
PLA Probe Anti-Rabbit PLUS Sigma-Aldrich DUO92002 Contains 1x Blocking solution, 1x antibody Diluent
Wash Buffers, Flurescence Sigma-Aldrich DUO82049 Contains Wash Buffer A and Wash Buffer B
Mounting Medium with DAPI Sigma-Aldrich DUO82040
Detection Reagents Red Sigma-Aldrich DUO92008 Contains 5x Ligation, 1x Ligase, 5x Amlification Red, 1x Polymerase
p44/42 MAPK (Erk1/2) Antibody Cell Signaling 9102s
Phospho-p44/42 MAPK (Erk1) (Tyr204)/(Erk2) (Tyr187) Cell Signaling 5726s pERK antibody
MST2 antibody Cell Signaling 3952s
Krs-2 (RJ-5) Santa Cruz sc-100449 MST1 antibody
16% Paraformaldehyde Electron microscopy sciences 15710 Dilute to 4% PFA in PBS for fixing solution
Triton x100 Fisher BioReagents BP 151-500 To prepare 0.1% Triton x-100 in 1xPBS for Permeabilization solution
Confocal microscopy Leica TCS SP8, 63x Image analysis with ImageJ software

References

  1. Zhou, D., et al. The Nore1B/Mst1 complex restrains antigen receptor-induced proliferation of naïve T cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (51), 20321-20326 (2008).
  2. Praskova, M., Xia, F., Avruch, J. MOBKL1A/MOBKL1B phosphorylation by MST1 and MST2 inhibits cell proliferation. Current Biology. 18 (5), 311-321 (2008).
  3. Dan, I., Watanabe, N. M., Kusumi, A. The Ste20 group kinases as regulators of MAP kinase cascades. Trends in Cell Biology. 11 (5), 220-230 (2001).
  4. Rawat, S. J., et al. H-ras Inhibits the Hippo Pathway by Promoting Mst1/Mst2Heterodimerization. Current Biology. 26 (12), 1556-1563 (2016).
  5. Creasy, C. L., Ambrose, D. M., Chernoff, J. The Ste20-like protein kinase, Mst1, dimerizes and contains an inhibitory domain. Journal of Biological Chemistry. 271 (35), 21049-21053 (1996).
  6. Buntru, A., Trepte, P., Klockmeier, K., Schnoegl, S., Wanker, E. E. Current Approaches Toward Quantitative Mapping of the Interactome. Frontiers in Genetics. 74 (7), (2016).
  7. Greenwood, C., Ruff, D., Kirvell, S., Johnson, G., Dhillon, H. S., Bustin, S. A. Proximity assays for sensitive quantification of proteins. Biomolecular Detection and Quantification. 4, 10-16 (2015).
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  10. Söderberg, O., et al. Direct observation of individual endogenous protein complexes in situ by proximity ligation. Nature Methods. 3 (12), 995-1000 (2006).

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Cite This Article
Karchugina, S., Chernoff, J. Detection of Heterodimerization of Protein Isoforms Using an in Situ Proximity Ligation Assay. J. Vis. Exp. (140), e57755, doi:10.3791/57755 (2018).

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