Heterodimerization in Situ yakınlık ligasyonu tahlil kullanarak Protein izoformlarının tespiti
Summary
İşte, bir yakınlık ligasyonu tahlil (PLA) ile yüksek hassasiyet MST1/MST2 heterodimerization sabit hücrelerdeki görselleştirmek için nasıl kullanılacağını göstermektedir.
Abstract
Düzenlenmiş protein-protein etkileşimleri çok sayıda sinyal olayı için temel bir ilke vardır ve bu tür olayların tespiti böyle yolları nasıl düzenlendiğini ve şekilleriyle anlamada önemli bir unsurdur. Protein-protein etkileşimleri hücrelerde algılamak için pek çok yöntem vardır, ancak nispeten az endojen proteinler arasındaki etkileşimler algılamak için kullanılabilir. Böyle bir yöntem, yakınlık ligasyonu tahlil (PLA), kullanımı tavsiye bir çok avantajı vardır. Protein-protein etkileşimi analiz ortak diğer yöntemlerine göre PLA nispeten yüksek duyarlılık ve özgüllük vardır, çok az hücre düzenleme ile burada açıklanan protokol yapılabilir, sadece iki hedef özgü gerektirir antikorlar farklı türlerden elde edilen (e.g., fare ve tavşan) ve bir özel reaktif: bir dizi belirli kovalent bağlı oligonucleotides olan ikincil antikorlar, birbirine yakın getirdiğimde, oluşturmak bir situ PCR veya çalışırken daire amplifikasyon amplifiable platformu. Bu sunum, biz MST1 ve MST2 yakınlık sabit hücrelerdeki değişiklikler görselleştirmek için PLA tekniği uygulamak gösterilmiştir. Bu el yazması açıklanan tekniği, özellikle hücre çalışmaları sinyal analizi için geçerlidir.
Introduction
MST1/Hippo sinyal kesintileri gelişimsel bozuklukları ve karsinojenezis1bağlı olmuştur. Memelilerde, MST1 ve MST2 kinaz etkinleştirin (fazdan) MOB1 ve LATS1/2, ikincisi olan daha sonra phosphorylates ve transkripsiyon ortak harekete geçirmek Evet ilişkili protein (YAP)2inaktive. Etkin (unphosphorylated) haliyle YAP oncogenic etkinlik, hücre proliferasyonu genlerin transkripsiyon artırılması vardır; Bunun tersi olarak, YAP Hippo yolu tarafından inaktive, hücre çoğalması bastırılır ve Apoptozis3terfi. Dokularda, esas olarak active homodimers, MST1 ve MST2 var ama oncogenic uyaranlara MST1/MST2 heterodimers düzeyleri artırabilir ve böyle heterodimers etkin olmayan4vardır. Ancak, MST1/MST2 heterodimerization nasıl düzenlenir kötü anlaşılır kalır. Homo – hem heterodimers aracılı ile C-terminal dolandı-coil MST1 bölgelerinde ve SARAH etki alanları5olarak bilinen MST2 arasındaki etkileşimler vardır. Bir in situ kullanarak PLA Bu makalede, biz insan Schwann hücreleri (HSC) ve insan embriyonik böbrek hücrelerinde (HEK-293) MST1/MST2 heterodimers varlığını göstermek gösterdi. Tespit ve transgene ifade ihtiyacı veya epitope Etiketler kullanımı sayısal endojen protein-protein etkileşimleri algılanmasını sağlar çünkü PLA diğer protein/protein etkileşim algılama yöntemleri üzerinde bir avantaj vardır 6.
Sinyal iletim yollarının büyük ölçüde bileşen proteinler koşullu Derneği tarafından kontrol edilir. Örneğin, çoğu reseptör Tirozin kinaz uyarılması kendi homo veya heteroseksüel dimerization ve ek hücre içi sinyal proteinleri, kendilerini izleyen ilişkilendirmesiyle formu daha fazla kompleksleri yol açar. Proteinler daha az 30-40 nm parçalara olması koşuluyla PLA yöntemin amacı hücrelerdeki proteinler arasında yakınlık görselleştirmek etmektir. Protein yakınlık genellikle ilk hücre içinde farklı tür kaldırdı uygun birincil antikorlar ile kuluçka tarafından tespit (Örn., tavşan ve fare) karşı etkileşen her protein, sonra species-specific ikincil antikorlar, ekleme önceden birleştiğinde kısa DNA sondalar. DNA probları yakın iseniz, belirli bir bağlantı DNA oligonükleotid aynı anda hem in situ PCR veya daire mekanizması haddeleme tarafından amplifikasyon için bir platform oluşturan Bu sondalar bağlayabilirsiniz. Floresan Etiketler amplifikasyon tepki eklendi görselleştirme kolayca sayılabilir ve hücre7,8, belirli bölgelere lokalize floresan noktalar olarak görünür etkileşen proteinlerin izin 9 , 10.
Protocol
Representative Results
Discussion
Cam odası slaytlar gibi çok çeşitli (14-16) hücre hatları ile deneme gerçekleştirmek uygundur ve örnek mikroskobu analizi sırasında her zaman değiştirmek için gerek yoktur bu deneme için kullanmak yararlı bulduk. Bir antikor ile çapraz bulaşma riski gibi bazı komplikasyonlar ortaya çıkabilir. Bu nedenle, biz her şey yıkama öneririz deneme artan süre rağmen bir Coplin kavanoz kullanmak yerine tek tek. Buna ek olarak, silikon Ekle kaldırılması hassas bir meseledir ve özen ve sabır ile yapılm…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
En iyi duruma getirme ve bu protokol, belirli Maria Radu ve Galina Semenova, doğrulanması için katkıda bulunmak için tüm Chernoff laboratuvar teşekkür ediyoruz. Andrey Efimov hücre Imaging tesisin Fox Chase Kanser Merkezi ayrıca teşekkür ederiz. Bu eser NIH (R01 CA148805) bir hibe için Dizayn Merkezi tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Chamber slides | Thermo Fisher Scientific | 178599 | 16 well, glass slide |
| PLA probe Anti-Mouse Minus | Sigma-Aldrich | DUO92004 | Contains 1x Blocking solution, 1x antibody Diluent |
| PLA Probe Anti-Rabbit PLUS | Sigma-Aldrich | DUO92002 | Contains 1x Blocking solution, 1x antibody Diluent |
| Wash Buffers, Flurescence | Sigma-Aldrich | DUO82049 | Contains Wash Buffer A and Wash Buffer B |
| Mounting Medium with DAPI | Sigma-Aldrich | DUO82040 | |
| Detection Reagents Red | Sigma-Aldrich | DUO92008 | Contains 5x Ligation, 1x Ligase, 5x Amlification Red, 1x Polymerase |
| p44/42 MAPK (Erk1/2) Antibody | Cell Signaling | 9102s | |
| Phospho-p44/42 MAPK (Erk1) (Tyr204)/(Erk2) (Tyr187) | Cell Signaling | 5726s | pERK antibody |
| MST2 antibody | Cell Signaling | 3952s | |
| Krs-2 (RJ-5) | Santa Cruz | sc-100449 | MST1 antibody |
| 16% Paraformaldehyde | Electron microscopy sciences | 15710 | Dilute to 4% PFA in PBS for fixing solution |
| Triton x100 | Fisher BioReagents | BP 151-500 | To prepare 0.1% Triton x-100 in 1xPBS for Permeabilization solution |
| Confocal microscopy | Leica TCS SP8, 63x | Image analysis with ImageJ software |
References
- Zhou, D., et al. The Nore1B/Mst1 complex restrains antigen receptor-induced proliferation of naïve T cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (51), 20321-20326 (2008).
- Praskova, M., Xia, F., Avruch, J. MOBKL1A/MOBKL1B phosphorylation by MST1 and MST2 inhibits cell proliferation. Current Biology. 18 (5), 311-321 (2008).
- Dan, I., Watanabe, N. M., Kusumi, A. The Ste20 group kinases as regulators of MAP kinase cascades. Trends in Cell Biology. 11 (5), 220-230 (2001).
- Rawat, S. J., et al. H-ras Inhibits the Hippo Pathway by Promoting Mst1/Mst2Heterodimerization. Current Biology. 26 (12), 1556-1563 (2016).
- Creasy, C. L., Ambrose, D. M., Chernoff, J. The Ste20-like protein kinase, Mst1, dimerizes and contains an inhibitory domain. Journal of Biological Chemistry. 271 (35), 21049-21053 (1996).
- Buntru, A., Trepte, P., Klockmeier, K., Schnoegl, S., Wanker, E. E. Current Approaches Toward Quantitative Mapping of the Interactome. Frontiers in Genetics. 74 (7), (2016).
- Greenwood, C., Ruff, D., Kirvell, S., Johnson, G., Dhillon, H. S., Bustin, S. A. Proximity assays for sensitive quantification of proteins. Biomolecular Detection and Quantification. 4, 10-16 (2015).
- Fredriksson, S., et al. Protein detection using proximity-dependent DNA ligation assays. Nature Biotechnology. 20 (5), 473-477 (2002).
- Leuchowius, K. J., et al. Parallel visualization of multiple protein complexes in individual cells in tumor tissue. Molecular & Cellular Proteomics. 12 (6), 1563-1571 (2013).
- Söderberg, O., et al. Direct observation of individual endogenous protein complexes in situ by proximity ligation. Nature Methods. 3 (12), 995-1000 (2006).
