Summary

Supresión de la señalización Pro-fibróticos potencia Factor-mediada la reprogramación de fibroblastos embrionarios de ratón en cardiomiocitos inducida

Published: June 03, 2018
doi:

Summary

Aquí presentamos un método robusto para reprogramar fibroblastos embrionarios primarios en cardiomiocitos funcionales a través de la sobreexpresión de GATA4, Hand2, Mef2c, Tbx5, miR-1 y miR-133 (GHMT2m) junto con la inhibición de la señalización de TGF-β. Nuestro protocolo genera cardiomiocitos paliza tan pronto como transducción después de 7 días con hasta un 60% eficiencia.

Abstract

Trans-diferenciación del tipo de una célula somática en otro tiene un enorme potencial para modelar y tratar enfermedades humanas. Estudios anteriores han demostrado que ratón embrionario, fibroblastos cutáneos y cardíacos pueden ser reprogramados en células similares de cardiomiocitos inducida funcionales (iCMs) a través de la sobreexpresión de factores de transcripción cardiogénico como GATA4, Hand2, Mef2c, y TBX5 in vitro e in vivo. Sin embargo, estos estudios previos han demostrado la eficacia relativamente baja. Para restablecer la función del corazón después de lesiones, mecanismos que regulan la reprogramación cardiaca deben ser aclados para aumentar la eficiencia y la maduración del iCMs.

Previamente demostramos que la inhibición de la señalización pro-fibróticos dramáticamente aumenta la eficiencia de reprogramación. Aquí, se detallan métodos para alcanzar una eficiencia de reprogramación de hasta un 60%. Además, se describen varios métodos incluyendo la citometría de flujo, imagen inmunofluorescente y proyección de imagen de calcio para cuantificar la eficiencia de reprogramación y la maduración de reprogramado fibroblastos. Utilizando el protocolo detallado aquí, pueden realizarse estudios mecanísticos para determinar los reguladores positivos y negativos de reprogramación cardiaca. Estos estudios pueden identificar vías de señalización que pueden ser dirigidas para promover la eficiencia de reprogramación y la maduración, que podría conducir a terapias celulares nuevos para el tratamiento de enfermedades del corazón humano.

Introduction

Cardiopatía isquémica es la principal causa de muerte en los Estados Unidos1. Aproximadamente 800.000 estadounidenses experimentan un primera o recurrente infarto de miocardio (IM) por año1. Después de MI, la muerte de los cardiomiocitos (CMs) y la fibrosis cardiaca, depositado por los fibroblastos cardiacos activados, afectar corazón función2,3. Progresión de la insuficiencia cardíaca después de MI es en gran medida irreversible debido a la pobre capacidad de regeneración de adultos CMs4,5. Mientras que los tratamientos clínicos actuales lenta progresión de la enfermedad y disminuyen el riesgo de eventos cardíacos futuros6,7,8,9, no hay terapias revertir la progresión de la enfermedad debido a la incapacidad de regenerar el CMs postinfarto10. Terapias celulares nuevos están emergiendo para tratar pacientes con mi desgracia, entrega de células madre al corazón después de MI hasta ahora los ensayos clínicos han demostrado concluyente regenerativo potencial11,12, 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18.

La generación de células pluripotentes inducidas derivadas de humanos (hiPSCs) de fibroblastos por la sobreexpresión de cuatro factores de transcripción, demostrada por primera vez por Takahashi & Yamanaka, abrió la puerta a nuevos avances en la terapia de la célula19. Estas células pueden distinguir en tres capas germinales todos19y varios métodos eficientes para la generación de grandes cantidades de CMs han demostrado previamente20,21. Derivados de HiPSC CMs (CMs-cadera) ofrece una poderosa plataforma para estudiar cardiomyogenesis y puede tener implicaciones importantes para reparar el corazón después de lesión. Sin embargo, CMs de caderas enfrentan actualmente aplicadas vallas debido a las preocupaciones de teratoma formación22, y su naturaleza inmadura puede ser pro-arritmogénico23. Reprogramación de fibroblastos en hiPSCs despertó interés en directamente reprogramar fibroblastos en otros tipos celulares. Ieda et al demostraron que la sobreexpresión de Mef2c y GATA4 y Tbx5 (GMT) en los resultados de fibroblastos en reprogramación directa al linaje cardíaco, aunque a bajo rendimiento24. Eficiencia de reprogramación fue mejorada con la adición de Hand2 (GHMT)25. Desde estos primeros estudios, numerosas publicaciones han demostrado que alterando el reprogramación factor cóctel con transcripción adicional factores26,27,28,29, modificadores de la cromatina30,31, microRNAs32,33o34 conduce a mejorar las moléculas pequeñas reprogramación eficiencia y maduración de células cardiomiocito inducidas (iCMs ).

Aquí proporcionamos un protocolo detallado para generar iCMs de fibroblastos embrionarios de ratón (MEFs) con alta eficiencia. Demostramos previamente que la GHMT cóctel se mejoró significativamente con la adición de los miR 1 y miR-133 (GHMT2m) y es mejorado cuando pro-fibróticos como transformación de factor de crecimiento β (TGF-β) señalización de rutas de señalización o Rho-associated vías de señalización de la proteína quinasa (ROCK) son inhibidos35. Mediante este protocolo, nos muestran que aproximadamente el 60% de las células express troponina T cardiaca (cTnT), aproximadamente el 50% expresan α-actinina, y un alto número de células de golpeo puede observarse tan pronto como el día 11 después de transducción de reprogramación factores y tratamiento con el TGF-β del tipo I inhibidor del receptor de A-83-01. Además, estos iCMs expresar proteínas de ensambladura de gap incluyendo connexin 43 y exhiben oscilaciones de calcio y la contracción espontánea. Esta marcada mejora en la eficiencia en comparación con estudios anteriores de reprogramación demuestra el potencial para regenerar CMs de poblaciones celulares endógenos que permanecen en el postinfarto de corazón.

Protocol

Todos los experimentos que requieren animales fueron aprobados por el cuidado institucional de animales y uso en la UC Denver Anschutz Medical Campus. 1. aislamiento de MEFs Comprar ratones C57BL/6 embarazadas E13. Nave durante la noche. Eutanasia a la madre según protocolos aprobados de IACUC (ex: ~1.3 CO L/min2 hasta que el animal aparece muerto seguido por dislocación cervical) La madre del aerosol con etanol al 70% y abrir la cavidad abdominal. El…

Representative Results

Usando la estrategia de reprogramación descrita anteriormente y en la figura 1B, generamos iCMs con aproximadamente 70% de las células cardiacas de troponina T y aproximadamente 55% de las células cardiaca α-actinina, cuantificado por citometría de flujo en el día 9 después de transducción de GHMT2m (figura 2A y B). Además, la mayoría de las células expresa cardiaca troponina T, troponina I y α-actini…

Discussion

El presente estudio esboza una estrategia de alta eficiencia para directamente reprogramar fibroblastos en iCMs funcional vía entrega de GHMT2m reprogramación factores combinados con la supresión de vías de señalización pro-fibróticos. Mediante citometría de flujo, la proyección de imagen inmunofluorescente, calcio imaging y superando a un recuento, nos muestran la mayoría de las células en este protocolo se someten a reprogramación exitosa y adoptar sino del linaje de CM. Previamente hemos demostrado que la …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Esta investigación fue apoyada por fondos de la Fundación Boettcher Webb Waring biomédica investigación programa, americano corazón Asociación científico desarrollo Grant (13SDG17400031), Departamento de la Universidad de Colorado de destacada carrera medicina Programa, de la Universidad de Colorado División de Cardiología Barlow Nyle dotación y R01HL133230 de NIH (a K.S). ASR fue apoyado por NIH/NCATS Colorado CTSA concesión número TL1TR001081 y una beca predoctoral del consorcio Universidad de Colorado para la investigación de la Fibrosis y traducción (CFReT). Esta investigación fue apoyada también por la concesión de apoyo Centro de cáncer (P30CA046934), beca de núcleos de investigación de enfermedades de piel (P30AR057212) y la base de Cytometry del flujo en el Universidad de Colorado Anschutz Medical Campus.

Materials

C57BL/6 Mice Charles River's Laboratory 027 For MEF isolation
Platinum E (PE) Cells Cell Biolabs, INC RV-101 For retrovirus production
DMEM High Glucose Gibco SH30022.FS Component of iCM, PE, and Growth media
Medium 199 Life Technologies 11150-059 Component of iCM media
Fetal Bovine Serum Gemini 100106 Component of iCM, PE, and Growth media
Donor Horse Serum Gemini 100508 500 Component of iCM media
MEM Essential Amino Acids, 50X Life Technologies 11130051 Component of iCM media
Sodium Pyruvate Solution, 100X Life Technologies 11360070 Component of iCM media and for calcium imaging
MEM Non-Essential Amino Acids, 100X Life Technologies 11140050 Component of iCM media
MEM Vitamin Solution, 100X Life Technologies 11120-052 Component of iCM media
Insulin-Transferrin-Selenium Gibco 41400045 Component of iCM media
B27 Gibco 17504-044 Component of iCM media
Penicilin-Streptomycin Gibco 15140-122 Component of iCM, PE, and Growth media
GlutaMAX (L-Glutamine Supplement) Gibco 35050-061 Component of iCM, PE, and Growth media
Blasticidin-HCl Life Technologies A11139-03 Component of PE media
Puromycin dihydrochloride Life Technologies A11138-03 Component of PE media
0.25% Trypsin/EDTA Gibco 25200-056 For detaching cells from culture dishes
A-83-01 R&D Systems – Tocris 2939/10 Treat cells to inhibit TGF-β signaling – promotes high efficiecy reprogramming. Use at 0.5 µM
DMSO Thermo Scientific 85190 For dilution and storage of A-83-01 and component of Freeze Medium
SureCoat Cellutron SC-9035 For coating dishes to plate MEFs
FuGENE 6 Transfection Reagent Promega E2692 Transfection Reagent
Opti-MEM Reduced Serum Media Gibco 11058-021 Transfection Reagent
pBabe-X Myc-GATA4 Plasmid containing reprogramming factor
pBabe-X Myc-Hand2 Plasmid containing reprogramming factor
pBabe-X Myc-Mef2c Plasmid containing reprogramming factor
pBabe-X Myc-Tbx5 Plasmid containing reprogramming factor
pBabe-X miR-1 Plasmid containing reprogramming factor
pBabe-X miR-133 Plasmid containing reprogramming factor
pBabe-X GFP Plasmid containing reprogramming factor
Polybrene (Hexadimethrine bromide) Sigma H9268-5G For viral induction. Use at a concentration of 6 µg/mL
Vacuum Filter + bottles (0.22 µm pores) Nalgene  569-0020  For filtering media
Syringes Bd Vacutainer Labware  309654 For viral filtration
0.45 µm Filters Celltreat 229749 For viral filtration
70 µm cell strainers Falcon  352350 For MEF isolation and Flow Cytometry
Cytofix/Cytoperm Solution BD 554722 For fixation and permeabilization of cells for flow cytometry
perm/wash buffer  BD 554723 For washing cells for flow cytometry
DPBS 1X Gibco 14190-250 For washing cells
Bovine Serum Albumin VWR 0332-100g For flow cytometry and calcium imaging
Goat Serum Sigma  G9023 For blocking cells for Flow Cytometry
Donkey Serum Sigma D9663-10mg For blocking cells for Flow Cytometry
Mouse Troponin T Thermo Scientific ms-295-p 1:400 IF, 1:200 Flow Cytometry
Mouse α-actinin Sigma A7811L 1:400 IF, 1:200 Flow Cytometry
Rabbit Connexin 43 Sigma  C6219 1:400 IF
Rabbit Troponin I PhosphoSolutions 2010-TNI 1:400 IF
Hoechst Life Technologies 62249 1:10000 IF
Alexa 488, rabbit Life Technologies A-11034 1:800 IF
Alexa 555, mouse Life Technologies A-21422 1:800 IF
Alexa 647, mouse Life Technologies A-31571 1:200 Flow Cytometry
27-color ZE5 Flow Cytometer  Bio-RAD For FACS
Paraformaldehyde sigma P6148-500mg For fixing cells for IF
Triton X-100 Promega H5142 For permeabilization of cells for IF
EVOS™ FL Color Imaging System Thermo Scientific AMEFC4300 For IF
NaCl RPI S23020-5000 For calcium imaging
KCl VWR 395 For calcium imaging
CaCl2 Fisher C614-500 For calcium imaging
MgCl2 VWR 97061-352 For calcium imaging
glucose sigma G7528-250g For calcium imaging
HEPES sigma H4034-500g For calcium imaging
Fura-2 AM Life Technologies F1221 For calcium imaging
Fluronic F-127 Sigma P2443-250g For calcium imaging
Nifedipine Sigma N7634-1G For disruption calcium transients in iCMs – use at 10 µM
Isoproterenol sigma I6504-1g For increasing number of calcium transients in iCMs – use at 1-2 µM
Marianas Spinning Disk Confocal microscope 3i For calcium imaging
ethanol Decon Laboratories 2801
bleach Clorox
50 mL conical tubes GREINER BIO-ONE 227261
15 mL conical tubes GREINER BIO-ONE 188271
15 cm cell culture dishes Falcon 353025
10 cm cell culture dishes Falcon 353003
60 mm cell culture dishes GREINER BIO-ONE 628160
6 well cell culture plates GREINER BIO-ONE 657160 
12 well cell culture plates GREINER BIO-ONE 665180 
24 well cell culture plates GREINER BIO-ONE 662160 

References

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Riching, A. S., Zhao, Y., Cao, Y., Londono, P., Xu, H., Song, K. Suppression of Pro-fibrotic Signaling Potentiates Factor-mediated Reprogramming of Mouse Embryonic Fibroblasts into Induced Cardiomyocytes. J. Vis. Exp. (136), e57687, doi:10.3791/57687 (2018).

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