Summary

قمع الإشارات برو تليفية يقوي التي تعالج بوساطة معامل إعادة برمجة الخلايا الليفية الجنينية الماوس في Cardiomyocytes المستحث

Published: June 03, 2018
doi:

Summary

نقدم هنا طريقة قوية لإعادة برمجة الخلايا الليفية الجنينية الأولية في cardiomyocytes الوظيفية من خلال أوفيريكسبريشن من GATA4، Hand2، Mef2c، Tbx5، مير-1، ومير-133 (GHMT2m) جنبا إلى جنب مع تثبيط الإشارات TGF-β. يولد لدينا بروتوكول cardiomyocytes الضرب أقرب وقت توصيل بعد 7 أيام بنسبة تصل إلى 60% الكفاءة.

Abstract

ترانس-التفريق بين نوع خلية جسدية واحدة إلى آخر إمكانات هائلة لنموذج وعلاج الأمراض التي تصيب الإنسان. أظهرت الدراسات السابقة أن الفأر الجنينية، يمكن برمجتها الليفية الجلدية، وأمراض القلب إلى الخلايا التي يسببها-كارديوميوسيتي-مثل الوظيفية (iCMs) من خلال overexpression عوامل النسخ كارديوجينيك بما في ذلك GATA4، Hand2، Mef2c، و Tbx5 على حد سواء في المختبر و في فيفو. ومع ذلك، أظهرت هذه الدراسات السابقة كفاءة منخفضة نسبيا. من أجل استعادة وظيفة القلب بعد الإصابة، يجب توضيح الآليات التي تحكم إعادة برمجة القلب لزيادة الكفاءة والنضج من iCMs.

أظهرنا سابقا أن تثبيط الإشارات برو تليفية هائلة يزيد من كفاءة إعادة برمجة. هنا، نحن بالتفصيل الأساليب لتحقيق كفاءة إعادة برمجة لتصل إلى 60%. وعلاوة على ذلك، يصف لنا العديد من الطرق بما في ذلك التدفق الخلوي والتصوير إيمونوفلوريسسينت، وتصوير الكالسيوم لقياس كفاءة إعادة برمجة ونضوج الخلايا الليفية أعيدت برمجتها. استخدام البروتوكول بالتفصيل هنا، ميكانيكية يمكن إجراء دراسات لتحديد المنظمين الإيجابية والسلبية لإعادة برمجة القلب. هذه الدراسات قد تحدد مسارات الإشارات التي يمكن استهدافها لتشجيع إعادة برمجة الكفاءة والنضج، مما يمكن أن يؤدي إلى علاجات الخلية رواية لعلاج أمراض القلب البشري.

Introduction

مرض القلب الاقفاري سبب الرئيسي للوفاة في الولايات المتحدة1. تجربة الأميركيين تقريبا 800,000 أول أو المتكررة احتشاء عضلة القلب (ميتشيغن) كل سنة1. عقب مي، يضعف وفاة كارديوميوسيتيس (CMs) وتليف القلب، أودعت بتنشيط الخلايا الليفية القلب، قلب الدالة2،3. تطور قصور القلب بعد مي لا رجعة فيه إلى حد كبير نظراً لقدرة التجدد الفقراء من الكبار CMs4،5. بينما العلاجات السريرية الحالية بطء تطور المرض وتقليل مخاطر أحداث القلب المستقبل6،7،،من89، لا العلاجات عكس تطور المرض بسبب عدم القدرة على تجديد اتفاقية الأنواع المهاجرة احتشاء بعد10. تظهر الخلية رواية العلاجات لعلاج المرضى بعد “اللون مخيب للآمال”، وقد أظهرت التجارب السريرية إيصال الخلايا الجذعية للقلب بعد مي حتى الآن غير حاسمة التجدد المحتملة11،12، 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18.

توليد الخلايا الجذعية المشتقة من الإنسان المستحثة pluripotent (هيبسكس) من الخلايا الليفية التي overexpression من أربعة عوامل النسخ، تجلى أولاً تاكاهاشي & ياماناكا، فتحت الباب أمام اختراقات جديدة في خلية العلاج19. يمكن تمييز هذه الخلايا إلى كافة الطبقات الجرثومية الثلاث19، والعديد من الطرق عالية الكفاءة لتوليد إعداد كبيرة من الأنواع المهاجرة وقد ثبت سابقا20،21. CMs المستمدة من هيبسك (الوركين-CMs) يوفر منصة قوية لدراسة كارديوميوجينيسيس، وقد آثار هامة بالنسبة لإصلاح القلب بعد الإصابة. ومع ذلك، الوركين-المهاجرة تواجه حاليا عقبات متعدية الجنسيات بسبب المخاوف من تيراتوما تشكيل22، وقد تكون طبيعتها غير ناضجة برو-أرهيثموجينيك23. إعادة برمجة الخلايا الليفية في هيبسكس آثار الاهتمام في مباشرة إعادة برمجة الخلايا الليفية في أنواع الخلايا الأخرى. إيدا et al. أثبتت أن overexpression من GATA4 و Mef2c و Tbx5 (بتوقيت جرينتش) في نتائج الليفية في إعادة برمجة مباشرة إلى النسب القلب، أن كان ذلك في انخفاض كفاءة24. تم تحسين برمجة الكفاءة بالإضافة إلى Hand2 (غمت)25. ومنذ هذه الدراسات المبكرة، أثبتت العديد من المنشورات أن تغيير كوكتيل عامل إعادة برمجة مع النسخ الإضافية من العوامل26،27،،من2829، برمجة الكروماتين معدلات30،31أو32،ميكرورناس33الجزيئات الصغيرة34 يؤدي إلى تحسين الكفاءة و/أو نضوج المستحث كارديوميوسيتي مثل الخلايا (iCMs ).

ونقدم هنا بروتوكول مفصل لتوليد iCMs من الخلايا الليفية الجنينية الماوس (MEFs) بكفاءة عالية. ونحن سابقا أظهر أن غمت كوكتيل هو تحسن كبير بالإضافة إلى مير-1 ومير-133 (GHMT2m)، وكذلك تحسين عند برو-تليفية إشارات المسارات بما في ذلك تحويل عامل النمو بيتا (TGF-β) إشارات أو المرتبطة رو البروتين كيناز (روك) مسارات الإشارات التي تحول دون35. نحن استخدام هذا البروتوكول، تبين أن حوالي 60% خلايا عن القلب “تروبونين تي” (كتنت)، أعرب حوالي 50% عن α-أكتينين، ويمكن ملاحظة وجود عدد كبير من الخلايا الضرب أقرب يوم 11 بعد توصيل لإعادة برمجة العوامل والعلاج مع TGF-β من النوع الأول مثبط لمستقبلات A-83-01. وعلاوة على ذلك، هذه iCMs التعبير عن الفجوة تقاطع البروتينات بما في ذلك كونيكسين 43 ويحمل الانكماش عفوية والعابرين الكالسيوم. تحسن ملحوظ في إعادة برمجة الكفاءة مقارنة بالدراسات السابقة وهذا يدل على إمكانية تجديد اتفاقية الأنواع المهاجرة من السكان الخلية الذاتية التي تبقى في احتشاء عضلة القلب بعد.

Protocol

جميع التجارب التي تتطلب الحيوانات أقرتها لجنة الاستخدام UC دنفر انشوتز الطبية داخل حرم ورعاية الحيوان المؤسسية. 1-عزل ميفس شراء الفئران الحوامل C57BL/6 في E13. السفينة بين عشية وضحاها. Euthanize الأم وفقا للبروتوكولات المعتمدة في إياكوك (ت: ~1.3 CO لتر في الدقيقة2 حتى يظه?…

Representative Results

استخدام استراتيجية إعادة برمجة المبينة أعلاه وفي الشكل 1 باء، أنشأنا iCMs مع حوالي 70% خلايا معربا عن القلب “تروبونين تي” وحوالي 55% من الخلايا معربا عن القلب α-أكتينين، كمياً بالتدفق الخلوي في يوم 9 بعد توصيل GHMT2m (الشكل 2 أ وب). بالإضافة …

Discussion

تحدد هذه الدراسة استراتيجية ذات الكفاءة العالية لمباشرة إعادة برمجة الخلايا الليفية في iCMs الوظيفية عن طريق تسليم GHMT2m إعادة برمجة العوامل جنبا إلى جنب مع قمع برو تليفية مسارات الإشارات. استخدام التدفق الخلوي والتصوير إيمونوفلوريسسينت والكالسيوم التصوير، وضرب عدد خلايا، نعرض معظم الخلاي…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

هذا البحث كان تدعمها أموال من المؤسسة بوتشير وارنج ويب “الطبية الحيوية برنامج البحوث”، عالم جمعية القلب الأمريكية التنمية منحة (13SDG17400031)، جامعة كولورادو قسم الطب المهني المبكر المعلقة برنامج باحث، جامعة “كولورادو شعبة من أمراض القلب بارلو نيل” الهبات، والمعاهد الوطنية للصحة R01HL133230 (إلى كانساس). A.S.R أيده المعاهد الوطنية للصحة/نكتس كولورادو كتسا المنحة رقم TL1TR001081 وزمالة قبل دكتوراه من جامعة كولورادو الكونسورتيوم التليف البحوث والترجمة (كفريت). بتأييد هذه البحوث أيضا بمنحه دعم مركز السرطان (P30CA046934)، والمنحة النوى أبحاث أمراض الجلد (P30AR057212)، وجوهر التدفق الخلوي في حرم جامعة كولورادو انشوتز الطبية.

Materials

C57BL/6 Mice Charles River's Laboratory 027 For MEF isolation
Platinum E (PE) Cells Cell Biolabs, INC RV-101 For retrovirus production
DMEM High Glucose Gibco SH30022.FS Component of iCM, PE, and Growth media
Medium 199 Life Technologies 11150-059 Component of iCM media
Fetal Bovine Serum Gemini 100106 Component of iCM, PE, and Growth media
Donor Horse Serum Gemini 100508 500 Component of iCM media
MEM Essential Amino Acids, 50X Life Technologies 11130051 Component of iCM media
Sodium Pyruvate Solution, 100X Life Technologies 11360070 Component of iCM media and for calcium imaging
MEM Non-Essential Amino Acids, 100X Life Technologies 11140050 Component of iCM media
MEM Vitamin Solution, 100X Life Technologies 11120-052 Component of iCM media
Insulin-Transferrin-Selenium Gibco 41400045 Component of iCM media
B27 Gibco 17504-044 Component of iCM media
Penicilin-Streptomycin Gibco 15140-122 Component of iCM, PE, and Growth media
GlutaMAX (L-Glutamine Supplement) Gibco 35050-061 Component of iCM, PE, and Growth media
Blasticidin-HCl Life Technologies A11139-03 Component of PE media
Puromycin dihydrochloride Life Technologies A11138-03 Component of PE media
0.25% Trypsin/EDTA Gibco 25200-056 For detaching cells from culture dishes
A-83-01 R&D Systems – Tocris 2939/10 Treat cells to inhibit TGF-β signaling – promotes high efficiecy reprogramming. Use at 0.5 µM
DMSO Thermo Scientific 85190 For dilution and storage of A-83-01 and component of Freeze Medium
SureCoat Cellutron SC-9035 For coating dishes to plate MEFs
FuGENE 6 Transfection Reagent Promega E2692 Transfection Reagent
Opti-MEM Reduced Serum Media Gibco 11058-021 Transfection Reagent
pBabe-X Myc-GATA4 Plasmid containing reprogramming factor
pBabe-X Myc-Hand2 Plasmid containing reprogramming factor
pBabe-X Myc-Mef2c Plasmid containing reprogramming factor
pBabe-X Myc-Tbx5 Plasmid containing reprogramming factor
pBabe-X miR-1 Plasmid containing reprogramming factor
pBabe-X miR-133 Plasmid containing reprogramming factor
pBabe-X GFP Plasmid containing reprogramming factor
Polybrene (Hexadimethrine bromide) Sigma H9268-5G For viral induction. Use at a concentration of 6 µg/mL
Vacuum Filter + bottles (0.22 µm pores) Nalgene  569-0020  For filtering media
Syringes Bd Vacutainer Labware  309654 For viral filtration
0.45 µm Filters Celltreat 229749 For viral filtration
70 µm cell strainers Falcon  352350 For MEF isolation and Flow Cytometry
Cytofix/Cytoperm Solution BD 554722 For fixation and permeabilization of cells for flow cytometry
perm/wash buffer  BD 554723 For washing cells for flow cytometry
DPBS 1X Gibco 14190-250 For washing cells
Bovine Serum Albumin VWR 0332-100g For flow cytometry and calcium imaging
Goat Serum Sigma  G9023 For blocking cells for Flow Cytometry
Donkey Serum Sigma D9663-10mg For blocking cells for Flow Cytometry
Mouse Troponin T Thermo Scientific ms-295-p 1:400 IF, 1:200 Flow Cytometry
Mouse α-actinin Sigma A7811L 1:400 IF, 1:200 Flow Cytometry
Rabbit Connexin 43 Sigma  C6219 1:400 IF
Rabbit Troponin I PhosphoSolutions 2010-TNI 1:400 IF
Hoechst Life Technologies 62249 1:10000 IF
Alexa 488, rabbit Life Technologies A-11034 1:800 IF
Alexa 555, mouse Life Technologies A-21422 1:800 IF
Alexa 647, mouse Life Technologies A-31571 1:200 Flow Cytometry
27-color ZE5 Flow Cytometer  Bio-RAD For FACS
Paraformaldehyde sigma P6148-500mg For fixing cells for IF
Triton X-100 Promega H5142 For permeabilization of cells for IF
EVOS™ FL Color Imaging System Thermo Scientific AMEFC4300 For IF
NaCl RPI S23020-5000 For calcium imaging
KCl VWR 395 For calcium imaging
CaCl2 Fisher C614-500 For calcium imaging
MgCl2 VWR 97061-352 For calcium imaging
glucose sigma G7528-250g For calcium imaging
HEPES sigma H4034-500g For calcium imaging
Fura-2 AM Life Technologies F1221 For calcium imaging
Fluronic F-127 Sigma P2443-250g For calcium imaging
Nifedipine Sigma N7634-1G For disruption calcium transients in iCMs – use at 10 µM
Isoproterenol sigma I6504-1g For increasing number of calcium transients in iCMs – use at 1-2 µM
Marianas Spinning Disk Confocal microscope 3i For calcium imaging
ethanol Decon Laboratories 2801
bleach Clorox
50 mL conical tubes GREINER BIO-ONE 227261
15 mL conical tubes GREINER BIO-ONE 188271
15 cm cell culture dishes Falcon 353025
10 cm cell culture dishes Falcon 353003
60 mm cell culture dishes GREINER BIO-ONE 628160
6 well cell culture plates GREINER BIO-ONE 657160 
12 well cell culture plates GREINER BIO-ONE 665180 
24 well cell culture plates GREINER BIO-ONE 662160 

References

  1. Benjamin, E. J., et al. Heart Disease and Stroke Statistics-2017 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. 136 (20), (2017).
  2. Laflamme, M. A., Murry, C. E. Regenerating the heart. Nat. Biotechnol. 23 (7), 845-856 (2005).
  3. Mercola, M., Ruiz-Lozano, P., Schneider, M. D. Cardiac muscle regeneration: lessons from development. Genes & Development. 25 (4), 299-309 (2011).
  4. Bergmann, O., et al. Evidence for cardiomyocyte renewal in humans. Science. 324 (5923), 98-102 (2009).
  5. Senyo, S. E., et al. Mammalian heart renewal by pre-existing cardiomyocytes. Nature. 493 (7432), 433-436 (2013).
  6. Nabel, E. G., Braunwald, E. A tale of coronary artery disease and myocardial infarction. N Engl J Med. 366 (1), 54-63 (2012).
  7. Packer, M., et al. Effect of carvedilol on the morbidity of patients with severe chronic heart failure: results of the carvedilol prospective randomized cumulative survival (COPERNICUS) study. Circulation. 106 (17), 2194-2199 (2002).
  8. The CAPRICORN Investigators. Effect of carvedilol on outcome after myocardial infarction in patients with left-ventricular dysfunction: the CAPRICORN randomized trial. The Lancet. 357 (9266), 1385-1390 (2001).
  9. Marangou, J., Paul, V. Current attitudes on cardiac devices in heart failure: a review. Clin Ther. 37 (10), 2206-2214 (2015).
  10. Xin, M., Olson, E. N., Bassel-Duby, R. Mending broken hearts: cardiac development as a basis for adult heart regeneration and repair. Nat Rev Mol Cell Bio. 14 (8), 529-541 (2013).
  11. Wollert, K. C., et al. Intracoronary autologous bone-marrow cell transfer after myocardial infarction: the BOOST randomized controlled clinical trial. Lancet. 364 (9429), 141-148 (2004).
  12. Schachinger, V., et al. Intracoronary bone marrow-derived progenitor cells in acute myocardial infarction. N. Engl. J. Med. 355 (12), 1210-1221 (2006).
  13. Huikuri, H. V., et al. Effects of intracoronary injection of mononuclear bone marrow cells on left ventricular function, arrhythmia risk profile, and restenosis after thrombolytic therapy of acute myocardial infarction. Eur. Heart J. 29 (22), 2723-2732 (2008).
  14. Janssens, S., et al. Autologous bone marrow-derived stem-cell transfer in patients with ST-segment elevation myocardial infarction: double-blind, randomised controlled trial. Lancet. 367 (9505), 113-121 (2006).
  15. Lunde, K., et al. Intracoronary injection of mononuclear bone marrow cells in acute myocardial infarction. N. Engl. J. Med. 355 (12), 1199-1209 (2006).
  16. Hirsch, A., et al. Intracoronary infusion of autologous mononuclear bone marrow cells or peripheral mononuclear blood cells after primary percutaneous coronary intervention: rationale and design of the HEBE trial – a prospective, multicenter, randomized trial. Am. Heart J. 152 (3), 434-441 (2006).
  17. Hirsch, A., et al. Intracoronary infusion of mononuclear cells from bone marrow or peripheral blood compared with standard therapy in patients after acute myocardial infarction treated by primary percutaneous coronary intervention: results of the randomized controlled HEBE trial. Eur. Heart J. 32 (14), 1736-1747 (2011).
  18. Karantalis, V., et al. Autologous mesenchymal stem cells produce concordant improvements in regional function, tissue perfusion, and fibrotic burden when administered to patients undergoing coronary artery bypass grafting: The Prospective Randomized Study of Mesenchymal Stem Cell Therapy in Patients Undergoing Cardiac Surgery (PROMETHEUS) trial. Circ Res. 114 (8), 1302-1310 (2014).
  19. Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
  20. Lian, X., et al. Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling. Proc Natl Acad Sci. 109 (27), E1848-E1857 (2012).
  21. Loh, K. M., et al. Mapping the Pairwise Choices Leading from Pluripotency to Human Bone, Heart, and Other Mesoderm Cell Types. Cell. 166 (2), 451-467 (2016).
  22. Yoshida, Y., Yamanaka, S. iPS cells: A source of cardiac regeneration. J. Mol. Cell. Cardiol. 50 (2), 327-332 (2011).
  23. Shiba, Y., et al. Allogeneic transplantation of iPS cell-derived cardiomyocytes regenerates primate hearts. Nature. 538, 388-391 (2016).
  24. Ieda, M., et al. Direct reprogramming of fibroblasts into functional cardiomyocytes by defined factors. Cell. 142 (3), 357-386 (2010).
  25. Song, K., et al. Heart repair by reprogramming non-myocytes with cardiac transcription factors. Nature. 485, 599-604 (2012).
  26. Hirai, H., Katoku-Kikyo, N., Keirstead, S. A., Kikyo, N. Accelerated direct reprogramming of fibroblasts into cardiomyocyte-like cells with the MyoD transactivation domain. Cardiovasc Res. 100 (1), 105-113 (2013).
  27. Qian, L., Berry, E. C., Fu, J., Ieda, M., Srivastava, D. Reprogramming of mouse fibroblasts into cardiomyocyte-like cells in vitro. Nat Protoc. 8 (6), 1204-1215 (2013).
  28. Addis, R. C., et al. Optimization of direct fibroblast reprogramming to cardiomyocytes using calcium activity as a functional measure of success. J Mol Cell Cardiol. 60, 97-106 (2013).
  29. Ifkovitz, J. L., Addis, R. C., Epstein, J. A., Gearhart, J. D. Inhibition of TGFβ signaling increases direct conversion of fibroblasts to induced cardiomyocytes. PLoS One. 9 (2), e89678 (2014).
  30. Zhou, Y., et al. Bmi1 Is a Key Epigenetic Barrier to Direct Cardiac Reprogramming. Cell Stem Cell. 18 (3), 382-395 (2016).
  31. Christoforou, N., et al. Transcription factors MYOCD, SRF, Mesp1 and SMARCD3 enhance the cardio-inducing effect of GATA4, TBX5, and MEF2C during direct cellular reprogramming. PLoS One. 8 (5), e63577 (2013).
  32. Jayawardena, T. M., et al. MicroRNA induced cardiac reprogramming in vivo: evidence for mature cardiac myocytes and improved cardiac function. Circ Res. 116 (3), 418-424 (2015).
  33. Jayawardena, T. M., et al. MicroRNA-mediated in vitro and in vivo direct reprogramming of cardiac fibroblasts to cardiomyocytes. Circ Res. 110 (11), 1465-1473 (2012).
  34. Cao, N., et al. Conversion of human fibroblasts into functional cardiomyocytes by small molecules. Science. 352 (6290), 1216-1220 (2016).
  35. Zhao, Y., et al. High-efficiency reprogramming of fibroblasts into cardiomyocytes requires suppression of pro-fibrotic signalling. Nature Communications. 6, 1-15 (2015).
  36. Morita, S., Kojima, T., Kitamura, T. Plat-E: an efficient and stable system for transient packaging of retroviruses. Gene Therapy. 7, 1063-1066 (2000).
  37. Zhou, H., Dickson, M. E., Kim, M. S., Bassel-Duby, R., Olson, E. N. Akt1/protein kinase B enhances reprogramming of fibroblasts to functional cardiomyocytes. Proc Natl Acad Sci. 112 (38), 11864-11869 (2015).
  38. Zhou, H., et al. ZFN281 enhances cardiac reprogramming by modulating cardiac and inflammatory gene expression. Genes & Dev. 31, 1770-1783 (2017).
  39. Mohamed, T. M., et al. Chemical Enhancement of In Vitro and In Vivo Direct Cardiac Reprogramming. Circulation. 135, 978-995 (2017).
  40. Qian, L., et al. In vivo reprogramming of murine cardiac fibroblasts into induced cardiomyocytes. Nature. 485, 593-598 (2012).
  41. Mathison, M., et al. In situ reprogramming to transdifferentiate fibroblasts into cardiomyocytes using adenoviral vectors: Implications for clinical myocardial regeneration. J Thorac Cardiovasc Surg. , 329-339 (2017).

Play Video

Cite This Article
Riching, A. S., Zhao, Y., Cao, Y., Londono, P., Xu, H., Song, K. Suppression of Pro-fibrotic Signaling Potentiates Factor-mediated Reprogramming of Mouse Embryonic Fibroblasts into Induced Cardiomyocytes. J. Vis. Exp. (136), e57687, doi:10.3791/57687 (2018).

View Video