通过 GATA4、Hand2、Mef2c、Tbx5、miR-1 和 miR-133 (GHMT2m) 的过度表达和 TGF β信号的抑制, 我们提出了一种健壮的方法, 将原发成纤维细胞重新编程成功能性心肌细胞。我们的协议在7天后的转导中产生跳动的心肌细胞, 效率高达60%。
将一种体细胞类型转化为另一种躯体细胞, 具有巨大的模型和治疗人类疾病的潜力。以前的研究表明, 小鼠胚胎, 真皮和心脏成纤维细胞可以重新编程成功能性诱发心肌样的干细胞 (iCMs) 通过过度表达的心源性转录因子, 包括 GATA4, Hand2, Mef2c, 和Tbx5体外和体内。然而, 这些先前的研究显示效率相对较低。为了恢复损伤后的心脏功能, 必须阐明调节心脏重新编程的机制, 以提高 iCMs 的效率和成熟度。
我们以前证明, 抑制亲纤维化信号显着提高重新编程效率。在这里, 我们详细的方法来实现编程效率高达60%。此外, 我们描述了几种方法, 包括流式细胞术, 免疫荧光成像, 钙成像, 以量化重新编程效率和成熟的重组成纤维细胞。通过这里详细的协议, 可以进行机械研究, 以确定积极和消极的调节心脏重新编程。这些研究可以确定信号通路, 可针对促进重新编程的效率和成熟, 这可能导致新的细胞治疗人类心脏病。
缺血性心脏病是美国的主要死因1。大约80万美国人每年经历第一次或复发性心肌梗塞 (MI)1。继 MI 后, 心肌细胞 (CMs) 的死亡和心肌纤维化, 由活化的心脏成纤维形成, 损害心脏功能2,3。由于成人 CMs4、5的再生能力较差,MI 后心力衰竭的进展很大程度上是不可逆转的。虽然目前的临床治疗缓慢疾病进展和降低未来心脏事件的风险6,7,8,9, 没有治疗逆转疾病进展由于无法重新生成 CMs 后梗塞10。新的细胞疗法正在出现, 以治疗患者继 mi. 令人失望的是, 迄今为止, 通过 mi 向心脏提供干细胞的临床试验显示了不确定的再生潜能11,12,13,14,15,16,17,18。
通过对四种转录因子的过度表达, 首次证明了由高桥 & Yamanaka 产生的人源性诱导多能干细胞 (hiPSCs), 为细胞治疗的新突破打开了大门19。这些单元格可以区分为所有三个胚芽层19, 并且以前已经显示了一些高效的用于生成大量 CMs 的方法, 其中有20、21。HiPSC 衍生的 cms (髋关节 cms) 提供了一个强大的平台, 研究 cardiomyogenesis, 可能有重要的影响, 修复心脏后损伤。然而, 髋关节 CMs 目前面临的翻译障碍, 由于关注畸胎瘤形成22, 其不成熟的性质可能是亲致心律失常23。将成纤维细胞重新编程成 hiPSCs 激发了人们对直接重新编程成纤维细胞的兴趣。大意et . 表明, GATA4、Mef2c 和 Tbx5 (GMT) 在成纤维细胞中的过度表达导致了心脏谱系的直接重新编程, 尽管效率低下的24。通过添加 Hand2 (GHMT)25, 改进了重新编程效率。自这些早期研究以来, 许多出版物表明, 改变重新编程因子鸡尾酒与其他转录因子26,27,28,29,染色质修饰符30,31, microRNAs32,33, 或小分子34导致改进的重新编程效率和/或诱导心肌样细胞的成熟 (iCMs).
在这里, 我们提供了一个详细的协议, 以产生 iCMs 从小鼠胚胎成纤维细胞 (MEFs) 高效。我们以前表明, GHMT 鸡尾酒是显着改善, 增加了 miR-1 和 miR-133 (GHMT2m), 并进一步改善, 当亲纤维化信号通路, 包括转化生长因子β (TGF β) 信号或与蛋白质激酶 (岩石) 信号通路被抑制35。使用该协议, 我们表明大约60% 的细胞表达心肌肌钙蛋白 T (cTnT), 约50% 表达α actinin, 和大量的殴打细胞可以观察到11天后, 后再编程因素和治疗转导与 TGF β型 I 受体抑制剂 A-83-01。此外, 这些 iCMs 的表达间隙连接蛋白包括 43, 并呈现自发收缩和钙瞬变。与早期研究相比, 重新编程效率的显著提高表明了在脑梗塞后的内源细胞群中再生 CMs 的潜力。
本研究概述了一种高效的策略, 通过 GHMT2m 重编程因子结合抑制亲纤维化信号通路, 直接将成纤维细胞重新编程为功能 iCMs。通过流式细胞术、免疫荧光成像、钙成像和跳动细胞计数, 我们表明该协议中的大多数细胞都经过成功的重编程, 并采用 CM 血统的命运。我们以前已经表明, 添加抗纤维化化合物, 包括 TGF β I 型受体抑制剂 A-83-01 产生约6倍的数量增加殴打 iCMs 相比, 转导与 GHMT2m 单独, 表明亲纤维…
The authors have nothing to disclose.
这项研究得到了来自 Boettcher 基金会韦伯-华林生物医学研究项目的资金支持, 美国心脏协会科学家发展补助金 (13SDG17400031), 科罗拉多大学医学系杰出的早期职业生涯学者计划, 科罗拉多大学心脏科洛 Nyle 捐赠和 NIH R01HL133230 (到 K)。犍为县 R 得到了美国国立卫生研究院/NCATS 科罗拉多 CTSA 赠款号 TL1TR001081 和科罗拉多大学纤维化研究 & 翻译协会 (CFReT) 博士研究生奖学金的支持。这项研究也得到了癌症中心支持补助金 (P30CA046934), 皮肤病研究核心赠款 (P30AR057212), 以及在科罗拉多大学安舒茨医学院的流式细胞术核心的支持。
C57BL/6 Mice | Charles River's Laboratory | 027 | For MEF isolation |
Platinum E (PE) Cells | Cell Biolabs, INC | RV-101 | For retrovirus production |
DMEM High Glucose | Gibco | SH30022.FS | Component of iCM, PE, and Growth media |
Medium 199 | Life Technologies | 11150-059 | Component of iCM media |
Fetal Bovine Serum | Gemini | 100106 | Component of iCM, PE, and Growth media |
Donor Horse Serum | Gemini | 100508 500 | Component of iCM media |
MEM Essential Amino Acids, 50X | Life Technologies | 11130051 | Component of iCM media |
Sodium Pyruvate Solution, 100X | Life Technologies | 11360070 | Component of iCM media and for calcium imaging |
MEM Non-Essential Amino Acids, 100X | Life Technologies | 11140050 | Component of iCM media |
MEM Vitamin Solution, 100X | Life Technologies | 11120-052 | Component of iCM media |
Insulin-Transferrin-Selenium | Gibco | 41400045 | Component of iCM media |
B27 | Gibco | 17504-044 | Component of iCM media |
Penicilin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | Component of iCM, PE, and Growth media |
GlutaMAX (L-Glutamine Supplement) | Gibco | 35050-061 | Component of iCM, PE, and Growth media |
Blasticidin-HCl | Life Technologies | A11139-03 | Component of PE media |
Puromycin dihydrochloride | Life Technologies | A11138-03 | Component of PE media |
0.25% Trypsin/EDTA | Gibco | 25200-056 | For detaching cells from culture dishes |
A-83-01 | R&D Systems – Tocris | 2939/10 | Treat cells to inhibit TGF-β signaling – promotes high efficiecy reprogramming. Use at 0.5 µM |
DMSO | Thermo Scientific | 85190 | For dilution and storage of A-83-01 and component of Freeze Medium |
SureCoat | Cellutron | SC-9035 | For coating dishes to plate MEFs |
FuGENE 6 Transfection Reagent | Promega | E2692 | Transfection Reagent |
Opti-MEM Reduced Serum Media | Gibco | 11058-021 | Transfection Reagent |
pBabe-X Myc-GATA4 | Plasmid containing reprogramming factor | ||
pBabe-X Myc-Hand2 | Plasmid containing reprogramming factor | ||
pBabe-X Myc-Mef2c | Plasmid containing reprogramming factor | ||
pBabe-X Myc-Tbx5 | Plasmid containing reprogramming factor | ||
pBabe-X miR-1 | Plasmid containing reprogramming factor | ||
pBabe-X miR-133 | Plasmid containing reprogramming factor | ||
pBabe-X GFP | Plasmid containing reprogramming factor | ||
Polybrene (Hexadimethrine bromide) | Sigma | H9268-5G | For viral induction. Use at a concentration of 6 µg/mL |
Vacuum Filter + bottles (0.22 µm pores) | Nalgene | 569-0020 | For filtering media |
Syringes | Bd Vacutainer Labware | 309654 | For viral filtration |
0.45 µm Filters | Celltreat | 229749 | For viral filtration |
70 µm cell strainers | Falcon | 352350 | For MEF isolation and Flow Cytometry |
Cytofix/Cytoperm Solution | BD | 554722 | For fixation and permeabilization of cells for flow cytometry |
perm/wash buffer | BD | 554723 | For washing cells for flow cytometry |
DPBS 1X | Gibco | 14190-250 | For washing cells |
Bovine Serum Albumin | VWR | 0332-100g | For flow cytometry and calcium imaging |
Goat Serum | Sigma | G9023 | For blocking cells for Flow Cytometry |
Donkey Serum | Sigma | D9663-10mg | For blocking cells for Flow Cytometry |
Mouse Troponin T | Thermo Scientific | ms-295-p | 1:400 IF, 1:200 Flow Cytometry |
Mouse α-actinin | Sigma | A7811L | 1:400 IF, 1:200 Flow Cytometry |
Rabbit Connexin 43 | Sigma | C6219 | 1:400 IF |
Rabbit Troponin I | PhosphoSolutions | 2010-TNI | 1:400 IF |
Hoechst | Life Technologies | 62249 | 1:10000 IF |
Alexa 488, rabbit | Life Technologies | A-11034 | 1:800 IF |
Alexa 555, mouse | Life Technologies | A-21422 | 1:800 IF |
Alexa 647, mouse | Life Technologies | A-31571 | 1:200 Flow Cytometry |
27-color ZE5 Flow Cytometer | Bio-RAD | For FACS | |
Paraformaldehyde | sigma | P6148-500mg | For fixing cells for IF |
Triton X-100 | Promega | H5142 | For permeabilization of cells for IF |
EVOS™ FL Color Imaging System | Thermo Scientific | AMEFC4300 | For IF |
NaCl | RPI | S23020-5000 | For calcium imaging |
KCl | VWR | 395 | For calcium imaging |
CaCl2 | Fisher | C614-500 | For calcium imaging |
MgCl2 | VWR | 97061-352 | For calcium imaging |
glucose | sigma | G7528-250g | For calcium imaging |
HEPES | sigma | H4034-500g | For calcium imaging |
Fura-2 AM | Life Technologies | F1221 | For calcium imaging |
Fluronic F-127 | Sigma | P2443-250g | For calcium imaging |
Nifedipine | Sigma | N7634-1G | For disruption calcium transients in iCMs – use at 10 µM |
Isoproterenol | sigma | I6504-1g | For increasing number of calcium transients in iCMs – use at 1-2 µM |
Marianas Spinning Disk Confocal microscope | 3i | For calcium imaging | |
ethanol | Decon Laboratories | 2801 | |
bleach | Clorox | ||
50 mL conical tubes | GREINER BIO-ONE | 227261 | |
15 mL conical tubes | GREINER BIO-ONE | 188271 | |
15 cm cell culture dishes | Falcon | 353025 | |
10 cm cell culture dishes | Falcon | 353003 | |
60 mm cell culture dishes | GREINER BIO-ONE | 628160 | |
6 well cell culture plates | GREINER BIO-ONE | 657160 | |
12 well cell culture plates | GREINER BIO-ONE | 665180 | |
24 well cell culture plates | GREINER BIO-ONE | 662160 |