Summary

Producción y purificación de Baculovirus para la aplicación de la terapia génica

Published: April 09, 2018
doi:

Summary

En este protocolo, baculovirus es producida por transitorios de la transfección del plásmido de baculovirus en células Sf9 y amplificado en una cultura de suspensión libre de suero. El sobrenadante es purificado por cromatografía de afinidad de heparina y más concentrado por ultracentrifugación. Este protocolo es útil para la producción y purificación de baculovirus para el uso de la terapia génica.

Abstract

Baculovirus se ha utilizado tradicionalmente para la producción de proteínas recombinantes y vacunas. Sin embargo, más recientemente, baculovirus se perfila como un prometedor vector para el uso de la terapia génica. Aquí, el baculovirus es producido por transitorios de la transfección del plásmido baculovirus ADN (bacmid) en una cultura adherente de células Sf9. Baculovirus se amplía posteriormente en células Sf9 en una cultura de suspensión libre de suero hasta obtener el volumen deseado. Luego se purifica de la cultura de sobrenadante mediante cromatografía de afinidad de heparina. Sobrenadante el virus es cargado en la columna de heparina que se une partículas de baculovirus en el sobrenadante debido a la afinidad de la heparina por baculovirus envuelven glicoproteína. La columna se lava con un buffer para eliminar los contaminantes y baculovirus es eluida de la columna con un amortiguador de sal. El eluido se diluye a una concentración isotónica de sal y baculovirus partículas están más concentrados mediante ultracentrifugación. Usando este método, baculovirus puede ser concentrado hasta 500-fold con una recuperación del 25% de partículas infecciosas. Aunque el protocolo descrito aquí muestra la producción y purificación de los baculovirus de culturas hasta 1 L, el método puede ser escalado-para arriba en una cultura de suspensión de sistema cerrado para producir un vector de tipo clínico para uso de la terapia génica.

Introduction

Baculovirus se utiliza principalmente para la producción de proteínas recombinantes y vacunas en lepidópteros Spodoptera fugiperda (Sf) 9 células de los insectos mediante el uso de recombinante virus de poliedrosis nuclear multicapsid de Autographa californica (AcMNPV) 1 , 2 , 3 , 4. más recientemente, se perfila como un prometedor vector gene terapia aplicación5. Es conocido por tener un amplio tropismo tejido y host, infecta las células quiescentes y proliferación, es no patógena y no integrar en el anfitrión cromosomas4,5,6. Además, se pueden producir baculovirus en cultura de suspensión libre de suero que es escalable y permite para sistema cerrado de procesamiento para la producción futura clínica1.

La pureza de las partículas de los baculovirus es importante para el logro de transducción eficaz minimizando la citotoxicidad7,8,9. Baculovirus puede concentrarse por ultracentrifugación o filtración de flujo tangencial (TFF) con impacto limitado en su infectividad. Sin embargo, estos procedimientos no sólo concentran las partículas del virus sino también detritos celulares y proteínas de Sf9 de la cultura, que pueden ser tóxicos en vitro (observación personal) y pueden inducir inflamación o respuesta inmune cuando se usa en vivo. Para evitar esto, sobre todo cuando uso altamente concentrado acciones de virus, baculovirus infecciosas debe ser purificado y separado de las partículas de contaminantes.

Varios métodos se han divulgado para la purificación y concentración de vectores de baculovirus10,11,12. De los métodos disponibles, cromatografía de afinidad de heparina permite un solo paso alto nivel de purificación con la baja concentración de contaminantes proteínas12. El método se basa en la identificación del sulfato del heparan como receptor de baculovirus13,14. Después de cargar el sobrenadante de células Sf9 sobre la columna y la vinculación de baculovirus, se puede lavar la columna con tampón fisiológico (isotónica) para eliminar partículas contaminantes ligeramente consolidadas o no consolidadas. Puesto que la Unión a la heparina es reversible, partículas de baculovirus pueden eluidas con un tampón salino alto, que se diluye inmediatamente a la concentración de sal (bebidas isotónica) fisiológica para evitar la inactivación por choque osmótico12. Por otra parte, la producción de baculovirus, así como captura en y la elución de la columna de cromatografía, se puede realizar mediante un proceso de sistema cerrado que es compatible con las actuales buenas prácticas de manufactura (cGMP).

Presentamos un protocolo detallado para la fabricación, purificación y concentración de baculovirus infecciosas mediante centrifugación y cromatografía de afinidad. Brevemente, producimos baculovirus por transfección de células Sf9 con un ADN de plásmido de baculovirus en cultura adherente y ampliar el baculovirus infecciosa en cultivo de suspensión libre de suero. Purificar el baculovirus mediante cromatografía de afinidad de heparina y usar ultracentrifugación como paso final para altamente concentrado el vector para el uso de la terapia génica.

Protocol

Vea la figura 1 para una ilustración que resume el protocolo. 1. purificación de ADN de plásmido de Baculovirus Crece cultivo bacteriano que contiene baculovirales plásmido ADN (bacmid)14 en 200 mL de LB caldo con antibióticos; kanamicina (50 μg/mL), tetraciclina (10 μg/mL) y gentamicina (7 μg/mL), de 16 h a 37 ° C en un entorno de Agitador orbital a 300 rpm. Purificar el bacmid ADN de la cultura bacteriana con …

Representative Results

El protocolo presentado es en un diagrama de flujo (figura 1). Los pasos incluyen los transitorios de la transfección de células Sf9 con bacmid ADN para producir baculovirus en cultura adherente en una placa, la amplificación posterior en cultura de suspensión libre de suero, nucleasa tratamiento y clarificación por centrifugación y filtración, y la purificación mediante la cromatografía de afinidad de heparina seguida por concentración con ultracen…

Discussion

El protocolo que presentamos describe la producción de baculovirus en células Sf9 en cultura de suspensión y purificación de baculovirus mediante una cromatografía de afinidad de heparina. Los parámetros utilizados en el presente Protocolo maximizan el rendimiento y minimizan la inactivación de baculovirus infecciosas. El protocolo que aquí se muestra que una recuperación significativamente mayor de partículas de baculovirus en comparación con recuperaciones alcanzada por otros9.

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Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabajo es apoyado en parte por la financiación de puesta en marcha de Fundación de investigación de niños de Cincinnati (CCPR) M.N. y el innovador núcleo Grant (ICG) apoyado por el centro nacional para avanzar las Ciencias traslacional de los institutos nacionales de salud en Premio número UL1 TR001425. El contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representan necesariamente las opiniones oficiales de los institutos nacionales de salud.

Materials

Akta Avant 150 GE Healthcare 28976337 Chromatography system
POROS Heparin 50 µm Column ThermoFisher Scientific 4333414 Heparin column
Ultracentrifuge Beckman-Coulter Non-catalog item Concentrates virus at high-speed
Polyallomer Ultracentrifuge tube Beckman-Coulter 326823 Concentrates virus at high-speed
MaxQ 8000 orbital shaker incubator  ThermoFisher Scientific Non-catalog item Shaker for suspension culture
250 mL Erlenmeyer flasks ThermoFisher Scientific 238071 Flask for suspension culture
1 L Erlenmeyer flasks ThermoFisher Scientific 238072 Flask for suspension culture
Microscope (Olympus CKX41) Olympus Non-catalog item Cell monitoring and counting 
Table top centrifuge ThermoFisher Scientific 75253839/433607 For clarification of Baculovirus supernatant
50 ml Conical tube ThermoFisher Scientific 14-959-49A For collection of Baculovirus supernatant
6-well plate ThermoFisher Scientific 07-200-80 Tissue culture treated plate
10-cm plate ThermoFisher Scientific 08-772E Tissue culture treated plate
Stericup-HV, 0.45 µm, PVDF EMD-Millipore SCHVU05RE Filtration unit
Kanamycin ThermoFisher Scientific 15160-054
Tetracycline Sigma-Aldrich T7660
Gentamycin ThermoFisher Scientific 15750-060
Bac-to-Bac Vector Kit ThermoFisher Scientific 10360-014 Baculovirus expression system
DH10B-T1R  Competent cell ThermoFisher Scientific 12331-013 Competent cell for bacmid
TE buffer In-house Non-catalog item 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0.
Plasmid Maxiprep kit ThermoFisher Scientific K2100-06 For bacmid purification
Sf9 Cells ThermoFisher Scientific 11496-015 Insect cells
Grace’s Insect Cell Culture Medium ThermoFisher Scientific 11605-094 Transfection medium
PBS ThermoFisher Scientific 20012227 Washing cells, diluting samples
HyClone SFX-Insect cell media GE Healthcare SH30278.02 Serum-free insect cell growth medium
Benzonase Nuclease Sigma-Aldrich E1014 Enzyme to degrade DNA and RNA
Baculovirus plasmid (bacmid) DNA In-house Non-catalog item Bacmid for Baculovirus Production
Cellfectin II  ThermoFisher Scientific 10362 Transfection reagent for insect cells
Bovine serum albumin (BSA) Sigma-Aldrich A4737 Stabilizes Baculovirus
Cryovial Thomas Scientific 1222C24 For storage of Baculovirus
HT1080 cell line ATCC CCL-121 Fibroblast cell line
DMEM Sigma-Aldrich D6429 Growth media for cell lines
Wash buffer In-house Non-catalog item 20 mmol/l phosphate buffer containing 150 mmol/l sodium chloride
Elution buffer In-house Non-catalog item 20 mmol/l phosphate buffer containing 1.5 mol/l sodium chloride
Column cleaning buffer In-house Non-catalog item 20 mmol/l phosphate buffer containing 2.0 mol/l sodium chloride
Sterile water In-house Non-catalog item For Akta Avant cleaning
Sodium hydroxide Sigma-Aldrich 1.09137 For Akta Avant cleaning
Ethanol Sigma-Aldrich E7073 For Akta Avant cleaning

References

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Cite This Article
Nasimuzzaman, M., van der Loo, J. C., Malik, P. Production and Purification of Baculovirus for Gene Therapy Application. J. Vis. Exp. (134), e57019, doi:10.3791/57019 (2018).

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