Summary

Produção e purificação de Baculovirus para aplicação de terapia gênica

Published: April 09, 2018
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Summary

Neste protocolo, baculovirus é produzido pelo transfection transiente de baculovirus plasmídeo em células Sf9 e amplificado em uma cultura de suspensão livre de soro. O sobrenadante é purificado por cromatografia de afinidade de heparina e mais concentrado por ultracentrifugação. Este protocolo é útil para a produção e purificação de baculovirus para aplicação de terapia de gene.

Abstract

Baculovirus tem sido tradicionalmente usada para a produção de proteínas recombinantes e vacina. No entanto, mais recentemente, baculovirus está emergindo como um vetor promissor para aplicação de terapia de gene. Aqui, baculovirus é produzido por transfecção transiente o baculovirus do ADN do plasmídeo (bacmid) numa cultura de Sf9 células aderente. Baculovirus posteriormente é expandido em Sf9 células em uma cultura livre de soro suspensão até obter o volume desejado. Em seguida é purificado da cultura sobrenadante usando cromatografia de afinidade de heparina. Sobrenadante de vírus é carregado na coluna de heparina, que se liga a partículas de baculovirus no sobrenadante devido a afinidade de heparina para baculovirus envelop glicoproteína. A coluna é lavada com um buffer para remover contaminantes e baculovirus é eluída da coluna com um buffer de elevado-sal. O eluato é diluído a uma concentração de sal isotônica e baculovirus partículas estão mais concentradas usando ultracentrifugação. Usando esse método, baculovirus pode ser concentrado até 500-fold com uma recuperação de 25% de partículas infecciosas. Embora o protocolo descrito aqui demonstra a produção e purificação do baculovirus de culturas até 1 L, o método pode ser dimensionado-se em uma cultura fechada-sistema de suspensão para produzir um vetor de grau clínico para aplicação de terapia de gene.

Introduction

Baculoviridae é usado principalmente para a produção de proteínas recombinantes e vacinas em lepidopteran Spodoptera fugiperda (Sf) 9 células de insetos usando recombinante Autographa californica vírus de poliedrose nuclear multicapsid (AcMNPV) 1 , 2 , 3 , 4. mais recentemente, está emergindo como um vetor promissor para gene terapia aplicação5. Ele é conhecido por ter um amplo acolhimento e tecido tropismo, infecta células quiescentes e proliferação, é não-patogênicas e não integrar o anfitrião cromossoma4,5,6. Além disso, baculovirus pode ser produzida em cultura de suspensão isento de soro que é escalável e permite o sistema fechado de processamento para produção futura Clínica1.

A pureza de baculovirus partículas é importante para a realização eficaz transdução minimizando a citotoxicidade7,8,9. Baculovirus pode ser concentrados por ultracentrifugação ou filtragem de fluxo tangencial (TFF) com impacto limitado na sua infecciosidade. No entanto, estes procedimentos não só concentrar partículas de vírus mas também restos celulares e proteínas de Sf9 cultura, que pode ser tóxico em vitro (observação pessoal) e podem induzir a inflamação ou uma resposta imune quando usado na vivo. Para evitar isso, especialmente quando usando altamente concentradas ações de vírus, baculovirus infecciosas precisa ser purificado e separado da contaminação de partículas.

Vários métodos têm sido relatados para a purificação e concentração de baculovirus vetores10,11,12. As abordagens disponíveis, cromatografia de afinidade de heparina permite um nível elevado de etapa única de purificação com a baixa concentração de proteínas12a contaminar. O método baseia-se na identificação do sulfato de heparan como receptor para baculovirus13,14. Depois de carregar Sf9 sobrenadante de célula na coluna e vinculação de baculovirus, a coluna pode ser lavada com buffer (isotônico) fisiológico para remover as partículas contaminantes frouxamente acopladas ou não acopladas. Desde que a ligação a heparina é reversível, baculovirus partículas podem ser eluídas com um buffer de sal elevado, o que dilui-se imediatamente a concentração de sal (isotônica) fisiológica para evitar inativação por choque osmótica12. Além disso, a produção de baculovirus, bem como captura na e eluição da coluna de cromatografia, pode ser realizada usando um processo do sistema fechado que é compatível com o atual boas práticas de fabricação (cGMP).

Aqui, nós fornecemos um protocolo detalhado para a manufatura, purificação e concentração de baculovirus infecciosas usando centrifugação e cromatografia de afinidade. Brevemente, produzimos baculovirus por transfecção de células Sf9 com um plasmídeo baculovirus em cultura aderente e expandir ainda mais o baculovirus infecciosas na cultura de suspensão livre de soro. Podemos purificar baculovirus usando cromatografia de afinidade de heparina e usar ultracentrifugação como etapa final para altamente concentrado do vetor para a aplicação de terapia de gene.

Protocol

Veja a Figura 1 para uma ilustração resumindo o protocolo. 1. purificação de Baculovirus plasmídeo Crescer a cultura bacteriana contendo baculoviral Plasmideo DNA (bacmid)14 em 200 mL de caldo LB com antibióticos; canamicina (50 µ g/mL), tetraciclina (10 µ g/mL) e gentamicina (7 µ g/mL), para 16 h a 37 ° C, em um cenário de agitador orbital a 300 rpm. Purificar o bacmid DNA da cultura bacteriana usando lise al…

Representative Results

O protocolo apresentado é em um diagrama de fluxo (Figura 1). As etapas incluem o transfection transiente de Sf9 células com bacmid DNA para produzir baculovirus em cultura aderente em uma placa, a subsequente amplificação em cultura de suspensão isento de soro, tratamento de nuclease e clarificação por centrifugação e filtração, e a purificação usando a cromatografia de afinidade de heparina seguido de concentração com ultracentrifugação.</p…

Discussion

O protocolo aqui apresentado descreve a produção de baculovirus no Sf9 células em cultura de suspensão e purificação de baculovirus usando uma cromatografia de afinidade de heparina. Os parâmetros usados neste protocolo maximizar o rendimento e minimizar a inactivação de baculovirus infecciosas. O protocolo fornecido aqui mostra que uma recuperação significativamente melhorada de baculovirus partículas em comparação com as recuperações alcançado por outros9.

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Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabalho é apoiado em parte financiando o start-up de Cincinnati infantil Research Foundation (CCRF) M.N. e inovador núcleo Grant (ICG) apoiado pelo centro nacional para Ciências translacionais avançando do National Institutes of Health, sob Prêmio número UL1 TR001425. O conteúdo é exclusivamente da responsabilidade dos autores e não representa necessariamente a opinião oficial do institutos nacionais da saúde.

Materials

Akta Avant 150 GE Healthcare 28976337 Chromatography system
POROS Heparin 50 µm Column ThermoFisher Scientific 4333414 Heparin column
Ultracentrifuge Beckman-Coulter Non-catalog item Concentrates virus at high-speed
Polyallomer Ultracentrifuge tube Beckman-Coulter 326823 Concentrates virus at high-speed
MaxQ 8000 orbital shaker incubator  ThermoFisher Scientific Non-catalog item Shaker for suspension culture
250 mL Erlenmeyer flasks ThermoFisher Scientific 238071 Flask for suspension culture
1 L Erlenmeyer flasks ThermoFisher Scientific 238072 Flask for suspension culture
Microscope (Olympus CKX41) Olympus Non-catalog item Cell monitoring and counting 
Table top centrifuge ThermoFisher Scientific 75253839/433607 For clarification of Baculovirus supernatant
50 ml Conical tube ThermoFisher Scientific 14-959-49A For collection of Baculovirus supernatant
6-well plate ThermoFisher Scientific 07-200-80 Tissue culture treated plate
10-cm plate ThermoFisher Scientific 08-772E Tissue culture treated plate
Stericup-HV, 0.45 µm, PVDF EMD-Millipore SCHVU05RE Filtration unit
Kanamycin ThermoFisher Scientific 15160-054
Tetracycline Sigma-Aldrich T7660
Gentamycin ThermoFisher Scientific 15750-060
Bac-to-Bac Vector Kit ThermoFisher Scientific 10360-014 Baculovirus expression system
DH10B-T1R  Competent cell ThermoFisher Scientific 12331-013 Competent cell for bacmid
TE buffer In-house Non-catalog item 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0.
Plasmid Maxiprep kit ThermoFisher Scientific K2100-06 For bacmid purification
Sf9 Cells ThermoFisher Scientific 11496-015 Insect cells
Grace’s Insect Cell Culture Medium ThermoFisher Scientific 11605-094 Transfection medium
PBS ThermoFisher Scientific 20012227 Washing cells, diluting samples
HyClone SFX-Insect cell media GE Healthcare SH30278.02 Serum-free insect cell growth medium
Benzonase Nuclease Sigma-Aldrich E1014 Enzyme to degrade DNA and RNA
Baculovirus plasmid (bacmid) DNA In-house Non-catalog item Bacmid for Baculovirus Production
Cellfectin II  ThermoFisher Scientific 10362 Transfection reagent for insect cells
Bovine serum albumin (BSA) Sigma-Aldrich A4737 Stabilizes Baculovirus
Cryovial Thomas Scientific 1222C24 For storage of Baculovirus
HT1080 cell line ATCC CCL-121 Fibroblast cell line
DMEM Sigma-Aldrich D6429 Growth media for cell lines
Wash buffer In-house Non-catalog item 20 mmol/l phosphate buffer containing 150 mmol/l sodium chloride
Elution buffer In-house Non-catalog item 20 mmol/l phosphate buffer containing 1.5 mol/l sodium chloride
Column cleaning buffer In-house Non-catalog item 20 mmol/l phosphate buffer containing 2.0 mol/l sodium chloride
Sterile water In-house Non-catalog item For Akta Avant cleaning
Sodium hydroxide Sigma-Aldrich 1.09137 For Akta Avant cleaning
Ethanol Sigma-Aldrich E7073 For Akta Avant cleaning

References

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Cite This Article
Nasimuzzaman, M., van der Loo, J. C., Malik, P. Production and Purification of Baculovirus for Gene Therapy Application. J. Vis. Exp. (134), e57019, doi:10.3791/57019 (2018).

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