Productie en zuivering van Baculovirus voor toepassing van de gentherapie
Summary
In dit protocol is baculovirus geproduceerd door voorbijgaande transfectie van baculovirus plasmide in Sf9 cellen en versterkt in een serumvrij schorsing cultuur. De bovendrijvende substantie is gezuiverd door de chromatografie van de affiniteit van heparine en verder geconcentreerd door ultracentrifugatie. Dit protocol is handig voor de productie en zuivering van baculovirus voor gen-therapie-toepassing.
Abstract
Baculovirus heeft van oudsher gebruikt voor de productie van recombinante eiwitten en vaccin. Echter, meer recentelijk, baculovirus ontpopt zich als een veelbelovende vector voor gen-therapie-toepassing. Hier, wordt baculovirus geproduceerd door voorbijgaande transfectie van het baculovirus plasmide DNA (bacmid) in een aanhangend cultuur van Sf9 cellen. Baculovirus wordt vervolgens uitgebreid in Sf9 cellen in een serumvrij schorsing cultuur totdat het gewenste volume is bereikt. Het wordt dan gezuiverd uit de cultuur supernatant met behulp van de chromatografie van de affiniteit van de heparine. Virus supernatant wordt geladen op de heparine-kolom die baculovirus deeltjes in de bovendrijvende substantie als gevolg van de affiniteit van heparine bindt voor baculovirus glycoproteïne omhullen. De kolom wordt gewassen met een buffer om het verwijderen van verontreinigingen en baculovirus uit de kolom met een hoge-zout-buffer wordt geëlueerd. Het eluaat is verdund tot een isotone zoutconcentratie en baculovirus deeltjes zijn verdere geconcentreerd met ultracentrifugatie. Met deze methode kan baculovirus worden geconcentreerd tot 500-fold met een 25% terugwinning van infectieuze deeltjes. Hoewel het protocol beschreven hier het productie en zuivering van de baculovirus uit culturen tot 1 L toont, de methode kan worden geschaald-up in een gesloten-systeem schorsing cultuur tot een klinische-grade vector voor gen-therapie-toepassing.
Introduction
Baculovirus wordt voornamelijk gebruikt voor de productie van recombinante eiwitten en vaccins in nachtvlinder Spodoptera fugiperda (Sf) 9 insect cellen met behulp van recombinant Autographa californica multicapsid nuclear polyhedrosis virus (AcMNPV) 1 , 2 , 3 , 4. meer recentelijk het ontpopt zich als een veelbelovende vector voor gene therapie toepassing5. Het is bekend dat er een brede host en weefsel tropisme, zowel rustige en delende cellen infecteert, is niet-pathogene en niet doet integreren in de host chromosoom4,5,6. Baculovirus kan bovendien worden geproduceerd in serumvrij schorsing cultuur die is schaalbaar en gesloten systeem verwerking voor toekomstige klinische productie1voorziet.
De zuiverheid van baculovirus deeltjes is belangrijk voor het bereiken van effectieve transductie terwijl het minimaliseren van de cytotoxiciteit7,8,9. Baculovirus kunnen worden geconcentreerd door ultracentrifugatie of tangentiële stroom filtratie (TFF) met beperkte invloed op de besmettelijkheid. Deze procedures niet alleen concentreren virusdeeltjes maar ook cellulaire puin en eiwitten uit de Sf9 cultuur, die kan worden giftig in vitro (persoonlijke opmerking) en kunnen leiden tot ontsteking of een immuunrespons wanneer gebruikt in vivo. Om dit te vermijden, vooral als met behulp van zeer geconcentreerd virusvoorraden, moet besmettelijke baculovirus worden gezuiverd en gescheiden van verontreinigende deeltjes.
Verschillende methoden zijn voor de zuivering en de concentratie van baculovirus vectoren10,11,12gerapporteerd. Van de beschikbare benaderingen zorgt de chromatografie van de affiniteit van de heparine voor een-voor-stapmodus hoog niveau van zuivering met de lage concentratie van proteïnen12besmetten. De methode is gebaseerd op de identificatie van heparan sulfaat als de receptor voor baculovirus13,14. Na het laden van Sf9 cel supernatant op de kolom en de binding van baculovirus, kan de kolom worden gewassen met fysiologische (isotone) buffer om niet-afhankelijke of losjes gebonden verontreinigende deeltjes te verwijderen. Aangezien de binding aan heparine omkeerbaar is, kunnen baculovirus deeltjes met een hoog zout buffer, die onmiddellijk wordt verdund aan fysiologische (isotone) zoutconcentratie ter voorkoming van inactivatie door osmotische schok12worden geëlueerd. Bovendien, de productie van baculovirus, evenals vangen op en de elutie van de chromatografie-kolom, kan worden uitgevoerd met behulp van een gesloten-systeemproces die verenigbaar is met de huidige goede productiepraktijken (cGMP).
Hier bieden we een gedetailleerd protocol voor vervaardiging, zuivering, en concentratie van besmettelijke baculovirus met behulp van de chromatografie van de affiniteit en centrifugeren. Kortom, wij produceren baculovirus door transfectie van Sf9 cellen met een baculovirus plasmide DNA in aanhangend cultuur en verdere uitbreiding van de besmettelijke baculovirus in serumvrij schorsing cultuur. We zuiveren baculovirus met behulp van de chromatografie van de affiniteit van heparine en ultracentrifugatie gebruiken als de laatste stap te sterk concentreren de vector voor gen-therapie-toepassing.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het hier gepresenteerde protocol beschrijft de productie van baculovirus in Sf9 cellen in schorsing cultuur en zuivering van baculovirus met behulp van een chromatografie van de affiniteit van heparine. De parameters die worden gebruikt in dit protocol de opbrengst te maximaliseren en minimaliseren de inactivering van besmettelijke baculovirus. Het protocol hier toont dat een aanzienlijk verbeterde herstel van baculovirus deeltjes ten opzichte van terugvorderingen bereikt door anderen9.
<p cla…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk wordt gedeeltelijk ondersteund door de Start-Up financiering uit Cincinnati Children’s Research Foundation (CCRF) voor M.N. en innovatieve Core Grant (ICG) ondersteund door het National Center for Advancing translationeel Wetenschappen van de National Institutes of Health onder Award nummer UL1 TR001425. De inhoud is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en vertegenwoordigt niet noodzakelijk de officiële standpunten van de National Institutes of Health.
Materials
| Akta Avant 150 | GE Healthcare | 28976337 | Chromatography system |
| POROS Heparin 50 µm Column | ThermoFisher Scientific | 4333414 | Heparin column |
| Ultracentrifuge | Beckman-Coulter | Non-catalog item | Concentrates virus at high-speed |
| Polyallomer Ultracentrifuge tube | Beckman-Coulter | 326823 | Concentrates virus at high-speed |
| MaxQ 8000 orbital shaker incubator | ThermoFisher Scientific | Non-catalog item | Shaker for suspension culture |
| 250 mL Erlenmeyer flasks | ThermoFisher Scientific | 238071 | Flask for suspension culture |
| 1 L Erlenmeyer flasks | ThermoFisher Scientific | 238072 | Flask for suspension culture |
| Microscope (Olympus CKX41) | Olympus | Non-catalog item | Cell monitoring and counting |
| Table top centrifuge | ThermoFisher Scientific | 75253839/433607 | For clarification of Baculovirus supernatant |
| 50 ml Conical tube | ThermoFisher Scientific | 14-959-49A | For collection of Baculovirus supernatant |
| 6-well plate | ThermoFisher Scientific | 07-200-80 | Tissue culture treated plate |
| 10-cm plate | ThermoFisher Scientific | 08-772E | Tissue culture treated plate |
| Stericup-HV, 0.45 µm, PVDF | EMD-Millipore | SCHVU05RE | Filtration unit |
| Kanamycin | ThermoFisher Scientific | 15160-054 | |
| Tetracycline | Sigma-Aldrich | T7660 | |
| Gentamycin | ThermoFisher Scientific | 15750-060 | |
| Bac-to-Bac Vector Kit | ThermoFisher Scientific | 10360-014 | Baculovirus expression system |
| DH10B-T1R Competent cell | ThermoFisher Scientific | 12331-013 | Competent cell for bacmid |
| TE buffer | In-house | Non-catalog item | 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0. |
| Plasmid Maxiprep kit | ThermoFisher Scientific | K2100-06 | For bacmid purification |
| Sf9 Cells | ThermoFisher Scientific | 11496-015 | Insect cells |
| Grace’s Insect Cell Culture Medium | ThermoFisher Scientific | 11605-094 | Transfection medium |
| PBS | ThermoFisher Scientific | 20012227 | Washing cells, diluting samples |
| HyClone SFX-Insect cell media | GE Healthcare | SH30278.02 | Serum-free insect cell growth medium |
| Benzonase Nuclease | Sigma-Aldrich | E1014 | Enzyme to degrade DNA and RNA |
| Baculovirus plasmid (bacmid) DNA | In-house | Non-catalog item | Bacmid for Baculovirus Production |
| Cellfectin II | ThermoFisher Scientific | 10362 | Transfection reagent for insect cells |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A4737 | Stabilizes Baculovirus |
| Cryovial | Thomas Scientific | 1222C24 | For storage of Baculovirus |
| HT1080 cell line | ATCC | CCL-121 | Fibroblast cell line |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D6429 | Growth media for cell lines |
| Wash buffer | In-house | Non-catalog item | 20 mmol/l phosphate buffer containing 150 mmol/l sodium chloride |
| Elution buffer | In-house | Non-catalog item | 20 mmol/l phosphate buffer containing 1.5 mol/l sodium chloride |
| Column cleaning buffer | In-house | Non-catalog item | 20 mmol/l phosphate buffer containing 2.0 mol/l sodium chloride |
| Sterile water | In-house | Non-catalog item | For Akta Avant cleaning |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 1.09137 | For Akta Avant cleaning |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7073 | For Akta Avant cleaning |
References
- Ikonomou, L., Schneider, Y. J., Agathos, S. N. Insect cell culture for industrial production of recombinant proteins. Appl Microbiol Biotechnol. 62 (1), 1-20 (2003).
- Contreras-Gomez, A., Sanchez-Miron, A., Garcia-Camacho, F., Molina-Grima, E., Chisti, Y. Protein production using the baculovirus-insect cell expression system. Biotechnol Prog. 30 (1), 1-18 (2014).
- Cox, M. M. Recombinant protein vaccines produced in insect cells. Vaccine. 30 (10), 1759-1766 (2012).
- Boyce, F. M., Bucher, N. L. Baculovirus-mediated gene transfer into mammalian cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (6), 2348-2352 (1996).
- Airenne, K. J., et al. Baculovirus: an insect-derived vector for diverse gene transfer applications. Mol Ther. 21 (4), 739-749 (2013).
- Sung, L. Y., et al. Efficient gene delivery into cell lines and stem cells using baculovirus. Nat Protoc. 9 (8), 1882-1899 (2014).
- Zeng, J., Du, J., Lin, J., Bak, X. Y., Wu, C., Wang, S. High-efficiency transient transduction of human embryonic stem cell-derived neurons with baculoviral vectors. Mol Ther. 17 (9), 1585-1593 (2009).
- Zeng, J., Du, J., Zhao, Y., Palanisamy, N., Wang, S. Baculoviral vector-mediated transient and stable transgene expression in human embryonic stem cells. Stem Cells. 25 (4), 1055-1061 (2007).
- Wu, C., Soh, K. Y., Wang, S. Ion-exchange membrane chromatography method for rapid and efficient purification of recombinant baculovirus and baculovirus gp64 protein. Hum Gene Ther. 18 (7), 665-672 (2007).
- Grein, T. A., Michalsky, R., Vega Lopez, M., Czermak, P. Purification of a recombinant baculovirus of Autographa californica M nucleopolyhedrovirus by ion exchange membrane chromatography. J Virol Methods. 183 (2), 117-124 (2012).
- Nasimuzzaman, M., Lynn, D., van der Loo, J. C., Malik, P. Purification of baculovirus vectors using heparin affinity chromatography. Mol Ther Methods Clin Dev. 3, 16071 (2016).
- Makkonen, K. E., Turkki, P., Laakkonen, J. P., Yla-Herttuala, S., Marjomaki, V., Airenne, K. J. 6-o- and N-sulfated syndecan-1 promotes baculovirus binding and entry into Mammalian cells. J Virol. 87 (20), 11148-11159 (2013).
- Nasimuzzaman, M. Heparan sulfate in baculovirus binding and entry of mammalian cells. J Virol. 88 (8), 4607-4608 (2014).
- Urabe, M., et al. Scalable generation of high-titer recombinant adeno-associated virus type 5 in insect cells. J Virol. 80 (4), 1874-1885 (2006).
- Feliciello, I., Chinali, G. A modified alkaline lysis method for the preparation of highly purified plasmid DNA from Escherichia coli. Anal Biochem. 212 (2), 394-401 (1993).
- Nasimuzzaman, M., Persons, D. A. Cell Membrane-associated heparan sulfate is a receptor for prototype foamy virus in human, monkey, and rodent cells. Mol Ther. 20 (6), 1158-1166 (2012).
- Earl, P. L., Americo, J. L., Moss, B. Development and use of a vaccinia virus neutralization assay based on flow cytometric detection of green fluorescent protein. J Virol. 77 (19), 10684-10688 (2003).
- Kim, Y. K., et al. Suppression of tumor growth in xenograft model mice by programmed cell death 4 gene delivery using folate-PEG-baculovirus. Cancer Gene Ther. 17 (11), 751-760 (2010).
- Stanbridge, L. J., Dussupt, V., Maitland, N. J. Baculoviruses as vectors for gene therapy against human prostate cancer. J Biomed Biotechnol. 2003 (2), 79-91 (2003).
- Nasimuzzaman, M., et al. Production and purification of high-titer foamy virus vector for the treatment of leukocyte adhesion deficiency. Mol Ther Methods Clin Dev. 3, 16004 (2015).
