ייצור, טיהור של Baculovirus עבור יישום ריפוי גנטי
Summary
ב פרוטוקול זה, baculovirus המיוצר על ידי תרביות תאים ארעית של baculovirus פלסמיד לתאים Sf9, הגביר בתרבות ללא סרום ההשעיה. תגובת שיקוע מטוהרת על-ידי הפארין כרומטוגרפיית זיקה, עוד יותר מרוכז על-ידי ultracentrifugation. פרוטוקול זה שימושי עבור ייצור וטיהור של baculovirus עבור יישום טיפול גנטי.
Abstract
Baculovirus באופן מסורתי שימש לייצור חלבון רקומביננטי, חיסון. עם זאת, לאחרונה, baculovirus מתגלה כמו וקטור המבטיח ליישום טיפול גנטי. כאן, baculovirus מופק על ידי תרביות תאים ארעית של פלסמיד baculovirus ה-DNA (bacmid) ב תרבות חסיד של תאים Sf9. Baculovirus לאחר מכן מורחב בתאים Sf9 תרבות ללא סרום השעיה עד לנפח הרצוי מתקבל. זה לאחר מכן מטוהרים מתרבות supernatant באמצעות כרומטוגרפיית זיקה הפארין. וירוס supernatant הוא טעון על גבי העמודה הפארין אשר נקשר baculovirus חלקיקים ב תגובת שיקוע עקב בזיקה של הפארין עבור baculovirus אופפים גליקופרוטאין. העמודה נשטף עם מאגר כדי להסיר מזהמים, baculovirus היא eluted מן העמודה עם מאגר מלח גבוהה. Eluate הוא מדולל ריכוז מלח מול, baculovirus חלקיקים הם הרבה יותר מרוכז באמצעות ultracentrifugation. באמצעות שיטה זו, baculovirus יכול להיות מרוכז עד 500-fold עם החלמה 25% של חלקיקים זיהומיות. אף על פי הפרוטוקול המתואר כאן מדגים את הייצור ואת טיהור של baculovirus מתרבויות עד 1 L, השיטה יכול להיות קנה המידה להמציא בתרבות סגור-מערכת המתלים לייצר וקטור קליני-כיתה ליישום טיפול גנטי.
Introduction
Baculovirus משמשת בעיקר לייצור של חומרים וחיסונים ב lepidopteran זחל כנימה fugiperda (Sf) 9 תאים חרקים באמצעות רקומביננטי קליפורניה Autographa וירוס multicapsid polyhedrosis הגרעין (AcMNPV) 1 , 2 , 3 , 4. לאחרונה, זה מתגלה כמו וקטור מבטיח עבור ג’ין טיפול יישום5. זה ידוע tropism רחב של המארח ורקמות, מדביק פריט שקט וגם מתרבים תאים, פתוגניים שאינם, לא לשלב המארח כרומוזום4,5,6. יתר על כן, baculovirus יכול להיות מיוצר בתרבות ללא סרום ההשעיה היא מדרגית ומאפשר למערכת סגורה, עיבוד ייצור קליניים עתידיים1.
הטוהר של חלקיקים baculovirus חשוב להשגת התמרה חושית יעילה תוך מזעור cytotoxicity-7,–8,–9. להיות מרוכזת Baculovirus על ידי ultracentrifugation או זרימה וצורניים סינון (TFF) עם השפעה מוגבלת על infectivity שלה. עם זאת, נהלים אלה לא רק להתרכז חלקיקי וירוס אבל גם פסולת הסלולר וחלבונים מן Sf9 תרבות, אשר יכול להיות רעיל במבחנה (תצפית אישי), עלול לגרום לדלקת או תגובה חיסונית כאשר נעשה שימוש ב- vivo. כדי להימנע מכך, במיוחד בעת שימוש מאוד מרוכז וירוס מניות, baculovirus זיהומית צריך להיות מטוהרים הופרדו מזהמות חלקיקים.
דווחו מספר שיטות לטיהור ודה-ריכוז של baculovirus וקטורים10,11,12. גישות זמין, הפארין כרומטוגרפיית זיקה מאפשר צעד אחר צעד רמה גבוהה של טיהור עם ריכוז נמוך של מזהם חלבונים12. השיטה מבוססת על זיהוי הפאראן גופרתי כמו רצפטור baculovirus13,14. לאחר טעינת תגובת שיקוע תא Sf9 עמודה ועל הכריכה של baculovirus, ניתן לשטוף את העמודה עם הפיזיולוגיות מאגר (מול) כדי להסיר חלקיקים מזהמים באופן רופף מאוגד או לא מאוגד. מאז האיגוד כדי הפארין הוא הפיך, חלקיקי baculovirus יכול להיות eluted עם מאגר מלח גבוהה, אשר הוא מדולל מיד כדי הפיזיולוגיות ריכוז המלחים (מול) כדי למנוע איון-שוק אוסמוטי12. יתר על כן, הייצור של baculovirus, כמו גם לוכדים במחשבים ואת • תנאי מן העמודה כרומטוגרפיה, ניתן לבצע באמצעות תהליך מערכת סגורה אשר תואמת נוהלי ייצור טוב הנוכחי (cGMP).
כאן, אנו מספקים פרוטוקול מפורט עבור ייצור, היטהרות, ריכוז של baculovirus זיהומיות באמצעות כרומטוגרפיית זיקה צנטריפוגה. בקצרה, אנו מייצרים baculovirus על ידי תרביות תאים תאים Sf9 עם פלסמיד baculovirus DNA בתרבות חסיד, להרחבה נוספת של baculovirus זיהומיות בתרבות ללא סרום ההשעיה. אנחנו לטהר baculovirus באמצעות כרומטוגרפיית זיקה הפארין ועושים שימוש ultracentrifugation השלב הסופי להתרכז מאוד הווקטור ליישום טיפול גנטי.
Protocol
Representative Results
Discussion
פרוטוקול המובאת כאן מתאר את הייצור של baculovirus בתאים Sf9 בתרבות ההשעיה ולטיהור baculovirus באמצעות כרומטוגרפיית זיקה של הפארין. הפרמטרים המשמשים פרוטוקול זה למקסם את התשואה ולצמצם את איון של baculovirus זיהומית. פרוטוקול שסופק כאן מראה שהחלמה משופרת באופן משמעותי של חלקיקים baculovirus לעומת ושחזורים מושגת…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכת באופן חלקי על ידי סטארט-אפ המימון של קרן המחקר (CCRF סינסינטי ילדים) ועד M.N. נתמך על ידי המרכז הלאומי עבור קידום מדעי Translational של מכוני הבריאות הלאומיים תחת גרנט הליבה החדשנית (ICG) פרס TR001425 UL1 מספר. התוכן הוא אך ורק באחריות המחברים, ואינם מייצגים בהכרח את הנופים הרשמי של מכוני הבריאות הלאומיים.
Materials
| Akta Avant 150 | GE Healthcare | 28976337 | Chromatography system |
| POROS Heparin 50 µm Column | ThermoFisher Scientific | 4333414 | Heparin column |
| Ultracentrifuge | Beckman-Coulter | Non-catalog item | Concentrates virus at high-speed |
| Polyallomer Ultracentrifuge tube | Beckman-Coulter | 326823 | Concentrates virus at high-speed |
| MaxQ 8000 orbital shaker incubator | ThermoFisher Scientific | Non-catalog item | Shaker for suspension culture |
| 250 mL Erlenmeyer flasks | ThermoFisher Scientific | 238071 | Flask for suspension culture |
| 1 L Erlenmeyer flasks | ThermoFisher Scientific | 238072 | Flask for suspension culture |
| Microscope (Olympus CKX41) | Olympus | Non-catalog item | Cell monitoring and counting |
| Table top centrifuge | ThermoFisher Scientific | 75253839/433607 | For clarification of Baculovirus supernatant |
| 50 ml Conical tube | ThermoFisher Scientific | 14-959-49A | For collection of Baculovirus supernatant |
| 6-well plate | ThermoFisher Scientific | 07-200-80 | Tissue culture treated plate |
| 10-cm plate | ThermoFisher Scientific | 08-772E | Tissue culture treated plate |
| Stericup-HV, 0.45 µm, PVDF | EMD-Millipore | SCHVU05RE | Filtration unit |
| Kanamycin | ThermoFisher Scientific | 15160-054 | |
| Tetracycline | Sigma-Aldrich | T7660 | |
| Gentamycin | ThermoFisher Scientific | 15750-060 | |
| Bac-to-Bac Vector Kit | ThermoFisher Scientific | 10360-014 | Baculovirus expression system |
| DH10B-T1R Competent cell | ThermoFisher Scientific | 12331-013 | Competent cell for bacmid |
| TE buffer | In-house | Non-catalog item | 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0. |
| Plasmid Maxiprep kit | ThermoFisher Scientific | K2100-06 | For bacmid purification |
| Sf9 Cells | ThermoFisher Scientific | 11496-015 | Insect cells |
| Grace’s Insect Cell Culture Medium | ThermoFisher Scientific | 11605-094 | Transfection medium |
| PBS | ThermoFisher Scientific | 20012227 | Washing cells, diluting samples |
| HyClone SFX-Insect cell media | GE Healthcare | SH30278.02 | Serum-free insect cell growth medium |
| Benzonase Nuclease | Sigma-Aldrich | E1014 | Enzyme to degrade DNA and RNA |
| Baculovirus plasmid (bacmid) DNA | In-house | Non-catalog item | Bacmid for Baculovirus Production |
| Cellfectin II | ThermoFisher Scientific | 10362 | Transfection reagent for insect cells |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A4737 | Stabilizes Baculovirus |
| Cryovial | Thomas Scientific | 1222C24 | For storage of Baculovirus |
| HT1080 cell line | ATCC | CCL-121 | Fibroblast cell line |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D6429 | Growth media for cell lines |
| Wash buffer | In-house | Non-catalog item | 20 mmol/l phosphate buffer containing 150 mmol/l sodium chloride |
| Elution buffer | In-house | Non-catalog item | 20 mmol/l phosphate buffer containing 1.5 mol/l sodium chloride |
| Column cleaning buffer | In-house | Non-catalog item | 20 mmol/l phosphate buffer containing 2.0 mol/l sodium chloride |
| Sterile water | In-house | Non-catalog item | For Akta Avant cleaning |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 1.09137 | For Akta Avant cleaning |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7073 | For Akta Avant cleaning |
References
- Ikonomou, L., Schneider, Y. J., Agathos, S. N. Insect cell culture for industrial production of recombinant proteins. Appl Microbiol Biotechnol. 62 (1), 1-20 (2003).
- Contreras-Gomez, A., Sanchez-Miron, A., Garcia-Camacho, F., Molina-Grima, E., Chisti, Y. Protein production using the baculovirus-insect cell expression system. Biotechnol Prog. 30 (1), 1-18 (2014).
- Cox, M. M. Recombinant protein vaccines produced in insect cells. Vaccine. 30 (10), 1759-1766 (2012).
- Boyce, F. M., Bucher, N. L. Baculovirus-mediated gene transfer into mammalian cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (6), 2348-2352 (1996).
- Airenne, K. J., et al. Baculovirus: an insect-derived vector for diverse gene transfer applications. Mol Ther. 21 (4), 739-749 (2013).
- Sung, L. Y., et al. Efficient gene delivery into cell lines and stem cells using baculovirus. Nat Protoc. 9 (8), 1882-1899 (2014).
- Zeng, J., Du, J., Lin, J., Bak, X. Y., Wu, C., Wang, S. High-efficiency transient transduction of human embryonic stem cell-derived neurons with baculoviral vectors. Mol Ther. 17 (9), 1585-1593 (2009).
- Zeng, J., Du, J., Zhao, Y., Palanisamy, N., Wang, S. Baculoviral vector-mediated transient and stable transgene expression in human embryonic stem cells. Stem Cells. 25 (4), 1055-1061 (2007).
- Wu, C., Soh, K. Y., Wang, S. Ion-exchange membrane chromatography method for rapid and efficient purification of recombinant baculovirus and baculovirus gp64 protein. Hum Gene Ther. 18 (7), 665-672 (2007).
- Grein, T. A., Michalsky, R., Vega Lopez, M., Czermak, P. Purification of a recombinant baculovirus of Autographa californica M nucleopolyhedrovirus by ion exchange membrane chromatography. J Virol Methods. 183 (2), 117-124 (2012).
- Nasimuzzaman, M., Lynn, D., van der Loo, J. C., Malik, P. Purification of baculovirus vectors using heparin affinity chromatography. Mol Ther Methods Clin Dev. 3, 16071 (2016).
- Makkonen, K. E., Turkki, P., Laakkonen, J. P., Yla-Herttuala, S., Marjomaki, V., Airenne, K. J. 6-o- and N-sulfated syndecan-1 promotes baculovirus binding and entry into Mammalian cells. J Virol. 87 (20), 11148-11159 (2013).
- Nasimuzzaman, M. Heparan sulfate in baculovirus binding and entry of mammalian cells. J Virol. 88 (8), 4607-4608 (2014).
- Urabe, M., et al. Scalable generation of high-titer recombinant adeno-associated virus type 5 in insect cells. J Virol. 80 (4), 1874-1885 (2006).
- Feliciello, I., Chinali, G. A modified alkaline lysis method for the preparation of highly purified plasmid DNA from Escherichia coli. Anal Biochem. 212 (2), 394-401 (1993).
- Nasimuzzaman, M., Persons, D. A. Cell Membrane-associated heparan sulfate is a receptor for prototype foamy virus in human, monkey, and rodent cells. Mol Ther. 20 (6), 1158-1166 (2012).
- Earl, P. L., Americo, J. L., Moss, B. Development and use of a vaccinia virus neutralization assay based on flow cytometric detection of green fluorescent protein. J Virol. 77 (19), 10684-10688 (2003).
- Kim, Y. K., et al. Suppression of tumor growth in xenograft model mice by programmed cell death 4 gene delivery using folate-PEG-baculovirus. Cancer Gene Ther. 17 (11), 751-760 (2010).
- Stanbridge, L. J., Dussupt, V., Maitland, N. J. Baculoviruses as vectors for gene therapy against human prostate cancer. J Biomed Biotechnol. 2003 (2), 79-91 (2003).
- Nasimuzzaman, M., et al. Production and purification of high-titer foamy virus vector for the treatment of leukocyte adhesion deficiency. Mol Ther Methods Clin Dev. 3, 16004 (2015).
