Summary

Lökosit işe kültürlü damar hücreleri ve yapışık trombositler üzerinde araştırmak için Laminar akış tabanlı deneyleri

Published: April 09, 2018
doi:

Summary

Lökosit heyecanla damar hücreleri ve trombositlerin damar duvar yaralanma sonra veya enflamasyon sırasında etkileşim. Burada, lökosit ve hücresel eşleri arasındaki etkileşimler altında yatan moleküler mekanizmaları karakterize etmek için basit bir laminar akış tabanlı tahlil açıklayın.

Abstract

Lökosit yaralanma veya iltihap sitelerine yaralanma veya doku hasarı üzerine alımı son yıllarda incelenmiş ve lökosit yapışma cascade kavramında sonuçlandı. Ancak, lökosit işe dahil tam moleküler mekanizmalar henüz tam olarak tespit edilmiştir değil. Lökosit işe alım enfeksiyon, inflamasyon ve (auto-) bağışıklık araştırma alanında önemli bir konu kalır bu yana, biz temel mekanizmaları yapıştırılması çalışma, de-yapışma için basit bir laminar akış tabanlı tahlil mevcut ve hicret Arteryel ve venöz akışı rejimler altında lökositlerin. Vitro tahlil lökosit ve damar iltihabı farklı modellerde hücresel eşleri arasındaki etkileşimler altında yatan moleküler mekanizmaları incelemek için kullanılabilir. Bu iletişim kuralı, lökosit ve endotel hücreleri veya görüntülenir ve sonra kaydedilen trombosit etkileşimleri çalışmaya paralel akış odası ve bir ters faz kontrast mikroskobu bir kameraya bağlı kullanarak bir laminar akış tabanlı tahlil açıklar çevrimdışı analiz. Endotel hücreleri, trombosit veya lökosit inhibitörleri veya bu işlem sırasında belirli molekülleri rolünü belirlemek için antikorlar ile pretreated. Kesme koşulları, Yani atardamar veya toplardamar kesme stres, kolayca viskozite ve perfused sıvı akış hızı ve kanal yüksekliği tarafından adapte edilebilir.

Introduction

Yaralanma, iltihap veya enfeksiyon lökosit hızlı patojen veya hasar-ilişkili için moleküler desen (PAMPs, DAMPs), aktif bir duruma değiştirmek ve inflamasyon ve doku hasarı sitelere kan akışı dışarı hareket yanıt. Onların hücresel ve moleküler çevre ile etkileşim olanağı lökositlerin lökosit yapışma eksikliği1gibi genetik bozukluklar tarafından vurgulanmış olarak bağışıklık hücreleri olarak onların doğru işlevi için esastır. Lökosit yapışma son on yıl boyunca yoğun soruşturma konusu olmuştur ve bu erken 1990’larda2,3lökosit yapışma cascade kavramı sonuçlandı. Lökosit yapışma lökositlerin endotel vasküler yüzey üzerinde rulo için hücreleri neden selektin-aracılı yakalama tarafından başlatılır. Bu inişli çıkışlı lökositlerin endotel bağımlı göçmen cues, örneğin, integrinler aktivasyonu teşvik kemokinler için taramak sağlar. Daha sonra aktif integrinler firma lökosit durması sonucu bağlama endotel ligandlar için aracılık. Lökosit daha sonra tarama ve endotel monolayer delici ve temel dokusuna transmigrating önce yayarak extravasate hazırlayabilirsiniz. Kurallı lökosit cascade temel kavramı sunulmasından bu yana büyük ölçüde değişmeden kalmıştır, bazı ara adımlar ile4ekledi. Yine de, tam moleküler mekanizmaları ve lökosit işe dahil birçok oyuncu rollerini şu ana kadar açıklık olmuştur değil ve lökosit işe alım enfeksiyon, inflamasyon ve (auto-) bağışıklık alanında önemli bir konu kalır araştırma.

Örneğin, ateroskleroz gibi vasküler inflamatuar hastalıklar sırasında gemi duvar sürücüler plak gelişme içine lökosit işe arttı. Kararsız aterosklerotik plaklar rüptürü, trombosit ve koagülasyon sisteminin büyük harekete geçirmek ve daha sonra5damar tıkanıklığı. Bu kalp krizi veya felç gibi ciddi kardiyovasküler sonuçlara yol açabilir. Buna ek olarak, klinik olarak, olarak endotel denudation oluşur örneğin bir koroner arter uygulaması sonra yol açar lökosit ve trombosit maruz damar duvar iç (örneğin, matris bileşenleri ve pürüzsüz etkileşimler çok sayıda kas hücreleri) ve vasküler yaralanma kapsayan trombosit ile lökositlerin. Bu etkileşimler monosit-trombosit etkileşimleri neointima oluşumu6,7sürücü olarak daha da geliştirilmesi hastalık için önemlidir. Buna ek olarak, trombosit-lökosit etkileşimleri lökosit integrin Mac-1 (αMβ2) aracılı ve trombosit GPIbα trombozu fareler8roman sürücüleri olarak son zamanlarda belirlenmiştir.

İnsan ve hayvan kan geniş durumu lökosit ve trombosit bir kaynak olarak araştırma ve izole matris molekülleri geniş yelpazede ve lökosit ve vasküler kökenli ölümsüzleştirdi hücre hatları için göz önüne alındığında, lökosit benzetimini yapmak için uygun etkileşimler bir laboratuvar ayarı, özel olarak tasarlanmış akışı perfüzyon Chambers’ı kullanarak akış altında. Adl değişik vakum odaklı kendinden yapışkanlı perfüzyon odalarına kadar geçen on yıl boyunca tasarlanmıştır. Tüm türevleri ortak yönü hareketsiz bölümü (örneğin, kültürlü damar hücreleri veya matris proteinler) önceden tanımlanmış bir kanal perfüzyon sıvıların hareketsiz bölümü üzerinde etkinleştirme ile donatılmış büyük bir sızıntı geçirmez odasına monte var. Buna ek olarak, teknoloji kalıp gelişmeler silis polimerler9tarihinde alan ısmarlama çözümler geliştirme etkin. Viskozite ve perfused sıvı akış hızı ve kanal yüksekliği esas olarak akış perfüzyon aygıt10makaslama stres özelliklerini belirlemek. Bu makalede, biz bir temel mekanizmaları yapıştırılması çalışma, de-yapışma için vitro yöntemi ve Hicret Arteryel ve venöz akışı rejimler altında lökositlerin mevcut. Burada sunulan yöntemleri onlar ortak kamera bağlı floresan mikroskop kullanılarak yapılır ve yüksek teknik yeterlilik Uluslararas› bir Denemecileri gerektirmeyen avantajdır. Vitro tahlil (inhibitörleri ekleyerek veya antikor engellemeörneğin,), birçok yönden manipüle edilebilir ve böylece damar iltihabı farklı modellerinde geçerli ve yapışma incelenmesi protein işlevleri sağlar veya belirli bileşikler değerlendirilmesi.

Protocol

Tüm yöntem tanımlamak burada tıbbi etik ve Maastricht University of hayvan etik kurulları tarafından onaylanmıştır. 1. akış tabanlı tahlil insan hücreleri ile İnsan kanı düşük trombosit yalıtım Venöz kan sitrat (% 3,2) antikoagülan çizin. Asit sitrat dekstroz hacmi 1/15 ekleyin (ACD: 80 mM TRISODYUM sitrat, 52 mM sitrik asit ve 183 mM glikoz) kan. 350 x g fren trombosit zengin plazma (PRP) elde etmek 15 dakika o…

Representative Results

Endotel lökosit yapışma çalışmaya fluorescently etiketli THP-1 hücreleri üzerinde 3 din/cm22 min için TNFα – veya sigara-uyarılmış endotel monolayer periosteum. Yapisan Monositik hücre toplam sayısı perfüzyon 2 dk sonra 6 bağımsız alan 2-6 dk bir süre içinde yakalama tarafından tespit edilmiştir. Yapışık hücreleri en az 6 resimleri bir ters faz kontrast/Floresans mikroskobu (örneğin, EVOS-FL) ele quantified bağlantılı CCD veya CMOS kame…

Discussion

Bu vitro tahlil vasküler enflamasyon sırasında lökosit alımı temel mekanizmaları araştırmak için basit bir yöntemdir, ancak dikkat edilmesi gereken bazı kritik nokta. Bu tahlil başarıyla gerçekleştirmek için ilk perfüzyon lökosit bir sağlam ve Konfluent vasküler veya trombosit monolayer gereksinimdir. Bu önceden kaplama kollajen türü olan yüzeylerin tarafından ben elde edilebilir. Genel olarak, birincil damar hücreleri ile çalışırken, yavaşça önerilen collagenase içeren dekolma…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Biz Drs. Martin M. Schmitt ve satır Fraemohs teşekkür ederim. Bu eser bilimsel araştırma (ZonMW VIDI 016.126.358, Landsteiner Vakfı kan nakli araştırma (LSBR Nr. 1638) ve Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB1123/A2) R.R.K. için ödül için Hollanda Vakfı tarafından desteklenmiştir

Materials

Inverted fluorescence microscope e.g. EVOS-FL Life Technologies Europe bv
Pump e.g. model: 210-CE  world precision instruments 78-9210W
Falcon 35 mm TC-Treated Easy-Grip Style Cell Culture Dish corning 353001
50 mL syringe Becton Dickinson 300137
Silicone tubing  VWR 228-0700
Elbow Luer Connector Male Ibidi 10802
Female Luer Lock Coupler Ibidi 10823
Flow chamber University Hospital RWTH Aachen Patent DE10328277A1: Baltus T, Dautzenberg R, Weber CPD. Strömungskammer zur in-vitro-Untersuchung von physiologischen Vorgängen an Zelloberflächen. 2005. 
Ibidi sticky slide VI 0.4 Ibidi 80608
Coverslips for sticky slides  Ibidi 10812
Collagen Type I, rat tail Life Technologies Europe bv A1048301
Recombinant Human TNF-α Peprotech 300-01A
Thrombin Receptor Activator for Peptide 6 (TRAP – 6) Anaspec / Eurogentec 24191
SYTO 13 green fluorescent nucleic acid stain Life Technologies Europe bv S7575
Hanks’ Balanced Salt Solution 10x Sigma-Aldrich Chemie H4641
HEPES buffer solution 1M, liquid Life Technologies Europe bv 15630049
BUMINATE Albumin, 25%  Baxter 60010
Water for injection B. Braun 3624315
Calcium chloride dihydrate Merck 102382 
Magnesium chloride hexahydrate  Sigma-Aldrich Chemie M2670
Apyrase Sigma-Aldrich Chemie A6535
Primary Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC) Promocell GmbH C-12203
Endothelial Cell Growth Medium (Ready-to-use) Promocell GmbH C-22010
Primary Human Aortic Endothelial Cells (HAoEC) ATCC  PCS-100-011
Vascular Cell Basal Medium  ATCC PCS-100-030
Endothelial Cell Growth Kit-BBE ATCC PCS-100-040
Primary Human Aortic Smooth Muscle Cells (HAoSMC) ATCC PCS-100-012
Vascular Smooth Muscle Cell Growth Kit ATCC PCS-100-042
Human endothelial cell line, EA.hy926 ATCC CRL-2922
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) ATCC 30-2002
Mouse endothelial cell line, SV 40 transformed (SVEC4-10) ATCC CRL-2181
Human Monocytic cell line, THP-1 DSMZ ACC-16
RPMI 1640 with Ultra-Glutamine Lonza BE12-702F/U1
Mouse monocyte/macrophage RAW264.7 ATCC TIB-71
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), high glucose Gibco 11965092
Accutase Promocell GmbH C-41310
Percoll Sigma-Aldrich Chemie P1644
Histopaque 1119 Sigma-Aldrich Chemie 11191
10x PBS Life Technologies Europe bv 14200075
BD Vacutainer Plastic Blood Collection Tubes with Sodium Heparin Becton Dickinson 367876
VACUETTE TUBE 9 ml 9NC Coagulation sodium citrate 3.2%  Greiner Bio 455322
HCl/EtOH mixture (1.2 mol/L HCl and 50% ethanol) in water Sigma-Aldrich Chemie Prepare by mixing 0.3L HCl (4 mol/L) with 0.7L of 70% v/v ethanol in a fume hood

References

  1. Dinauer, M. C. Primary immune deficiencies with defects in neutrophil function. American Society of Hematology. 2016 (1), 43-50 (2016).
  2. Butcher, E. C. Leukocyte-endothelial cell recognition: three (or more) steps to specificity and diversity. Cell. 67 (6), 1033-1036 (1991).
  3. Springer, T. A. Traffic signals for lymphocyte recirculation and leukocyte emigration: the multistep paradigm. Cell. 76 (2), 301-314 (1994).
  4. Nourshargh, S., Alon, R. Leukocyte migration into inflamed tissues. Immunity. 41 (5), 694-707 (2014).
  5. Legein, B., Temmerman, L., Biessen, E. A. L., Lutgens, E. Inflammation and immune system interactions in atherosclerosis. Cellular and Molecular Life Sciences. 70 (20), 3847-3869 (2013).
  6. Wang, Y., Sakuma, M., et al. Leukocyte engagement of platelet glycoprotein Ibalpha via the integrin Mac-1 is critical for the biological response to vascular injury. Circulation. 112 (19), 2993-3000 (2005).
  7. Zhao, Z., Vajen, T., et al. Deletion of junctional adhesion molecule A from platelets increases early-stage neointima formation after wire injury in hyperlipidemic mice. Journal of cellular and molecular medicine. , (2017).
  8. Wang, Y., Gao, H., et al. Leukocyte integrin Mac-1 regulates thrombosis via interaction with platelet GPIbα. Nature communications. 8, 15559 (2017).
  9. Fujii, T. PDMS-based microfluidic devices for biomedical applications. Microelectronic Engineering. 61-62, 907-914 (2002).
  10. Son, Y. Determination of shear viscosity and shear rate from pressure drop and flow rate relationship in a rectangular channel. Polymer. 48 (2), 632-637 (2007).
  11. Brinkmann, V., Laube, B., Abu Abed, U., Goosmann, C., Zychlinsky, A. Neutrophil extracellular traps: how to generate and visualize them. Journal of visualized experiments : JoVE. (36), e1724 (2010).
  12. Swamydas, M., Lionakis, M. S. Isolation, purification and labeling of mouse bone marrow neutrophils for functional studies and adoptive transfer experiments. Journal of visualized experiments : JoVE. (77), e50586 (2013).
  13. Schmitt, M. M. N., Megens, R. T. A., et al. Endothelial junctional adhesion molecule-a guides monocytes into flow-dependent predilection sites of atherosclerosis. Circulation. 129 (1), 66-76 (2014).

Play Video

Cite This Article
Vajen, T., Heinzmann, A. C., Dickhout, A., Zhao, Z., Nagy, M., Heemskerk, J. W., Koenen, R. R. Laminar Flow-based Assays to Investigate Leukocyte Recruitment on Cultured Vascular Cells and Adherent Platelets. J. Vis. Exp. (134), e57009, doi:10.3791/57009 (2018).

View Video