Summary

Analisi di flusso laminare-based per indagare il reclutamento leucocitario su cellule vascolari coltivate e piastrine aderenti

Published: April 09, 2018
doi:

Summary

Leucociti avidamente interagiscono con le cellule vascolari e le piastrine dopo lesione di parete del vaso o durante l’infiammazione. Qui, descriviamo un semplice test a flusso laminare per caratterizzare i meccanismi molecolari che sono alla base delle interazioni tra leucociti ed i loro partner cellulari.

Abstract

Il reclutamento dei leucociti su lesioni o infiammazione ai siti di lesione o danno tissutale è stato studiato durante gli ultimi decenni ed ha provocato il concetto della cascata di adesione del leucocita. Tuttavia, l’esatti meccanismi molecolari coinvolti nel reclutamento leucocitario non sono stati ancora completamente identificati. Dal momento che il reclutamento leucocitario rimane un tema importante nel campo dell’infezione, infiammazione e (auto-) ricerca immune, presentiamo un semplice test a flusso laminare per studiare meccanismi di fondo dell’aderenza, de-adesione, e trasmigrazione dei leucociti sotto i regimi di flusso venoso e arterioso. L’analisi in vitro può essere usata per studiare i meccanismi molecolari che sono alla base delle interazioni tra leucociti ed i loro partner cellulare in diversi modelli di infiammazione vascolare. Questo protocollo descrive un’analisi basata su flusso laminare usando una camera di flusso parallelo ed un microscopio invertito di contrasto di fase collegato ad una macchina fotografica per studiare le interazioni dei leucociti e cellule endoteliali o piastrine, che possono essere visualizzate e registrate poi analizzati non in linea. Le cellule endoteliali, piastrine o dei leucociti possono essere pretrattati con inibitori o anticorpi per determinare il ruolo di specifiche molecole durante questo processo. Condizioni di taglio, cioè arteriosi o venosi shear stress, possono essere facilmente adattate dalla viscosità e la portata dei fluidi irrorati e l’altezza del canale.

Introduction

Alla ferita, infiammazione o infezione, il leucociti rispondono rapidamente all’agente patogeno o danni associata – molecolare modelli (PAMPs, DAMPs), cambiare in uno stato di attivazione e spostare fuori dal flusso di sangue ai siti di infiammazione e danno tissutale. La capacità dei leucociti per interagire con l’ambiente cellulare e molecolare è essenziale per la loro corretta funzione come cellule immuni, come evidenziato da malattie genetiche come l’adesione del leucocita carenza1. L’adesione del leucocita è stato oggetto di intensa ricerca nel corso degli ultimi decenni e ciò ha provocato il concetto della cascata di adesione del leucocita nei primi anni 19902,3. L’adesione del leucocita è iniziata dalla cattura selectina-mediata dei leucociti all’endotelio, causando le cellule a rotolare sopra la superficie vascolare. Questo rotolamento permette di leucociti cercare spunti migratori endotelio associato, ad esempio, chemochine, che inducono l’attivazione delle integrine. Successivamente, le integrine attivate mediano l’associazione da ligandi endoteliali, con conseguente arresto del leucocita ferma. Leucociti successivamente possono preparare a MPEG strisciando e diffondendo, prima di penetrare il monostrato endoteliale e trasmigra in tessuto di fondo. Il concetto alla base della cascata del canonico del leucocita ha è rimasto pressoché invariato sin dalla sua introduzione, con alcuni passaggi intermedi aggiunto4. Tuttavia, i meccanismi molecolari esatti e i ruoli dei molti giocatori coinvolti nel reclutamento leucocitario non sono stati chiariti finora, e reclutamento leucocitario rimane un tema importante nel campo dell’infezione, infiammazione e (auto-) immuni ricerca.

Ad esempio, nel corso di malattie infiammatorie vascolari come l’aterosclerosi, aumentato reclutamento leucocitario nello sviluppo della placca vaso muro unità. Le placche aterosclerotiche instabili potrebbero rompersi, che conducono alla massiccia attivazione delle piastrine e del sistema di coagulazione e successivamente all’occlusione del vaso5. Ciò potrebbe comportare gravi esiti cardiovascolari come infarto miocardico o ictus. In più, per esempio dopo stenting di un’arteria coronaria, decumulazione endoteliali come esso si verifica clinicamente, conduce ad una moltitudine di interazioni dei leucociti e delle piastrine all’interno del muro vaso esposto (per esempio, componenti della matrice e liscio le cellule del muscolo) e dei leucociti con le piastrine che copre il danno vascolare. Queste interazioni sono importanti per l’ulteriore sviluppo della malattia come monociti e piastrine potrebbero guidare neointima formazione6,7. Inoltre, interazioni della piastrina-leucocitarie mediata da integrine leucocitarie Mac-1 (αMβ2) e della piastrina GPIbα sono state recentemente identificate come romanzo driver di trombosi in topi8.

Data l’ampia disponibilità di sangue umano e degli animale come fonte di leucociti e piastrine per la ricerca e l’ampio spettro di molecole di matrice isolato e linee cellulari immortalizzate di origine vascolare e del leucocita, è fattibile per simulare del leucocita interazioni in flusso in un laboratorio di impostazione, utilizzando appositamente progettato camere di aspersione di flusso. Molte varianti sono state progettate negli ultimi decenni, che vanno dal vuoto-driven agli alloggiamenti di aspersione autoadesiva. Tutte le varianti hanno in comune che la parte immobile (ad es., cellule vascolari coltivate o proteine della matrice) viene assemblata in una camera più grande di tenuta dotata di un pre-definito canale consentendo la perfusione di liquidi sopra la parte immobile. Inoltre, gli avanzamenti nella tecnologia di stampaggio permesso lo sviluppo di soluzioni su misura basate su silice polimeri9. La viscosità e la portata dei fluidi irrorati e l’altezza del canale principalmente di determinare le caratteristiche di sollecitazione di taglio del flusso perfusione periferica10. In questo articolo, presentiamo un metodo in vitro per lo studio dei meccanismi sottostanti dell’aderenza, de-adesione e la trasmigrazione dei leucociti sotto i regimi di flusso venoso e arterioso. Il vantaggio dei metodi presentati qui è che può essere eseguite utilizzando un microscopio a fluorescenza lecamera comune e non richiedono un sperimentatori di possedere alta competenza tecnica. Il saggio in vitro può essere manipolato in vari modi (ad esempio, l’aggiunta di inibitori o bloccando gli anticorpi) e così è applicabile a diversi modelli di infiammazione vascolare e permette l’indagine su adesione le funzioni della proteina o la valutazione di specifici composti.

Protocol

Tutti i metodi descritti qui sono stati approvati dai medici etici e animale etico tavole dell’Università di Maastricht. 1. flow-Based Assay con le cellule umane Isolamento delle piastrine da sangue umano Prelievo di sangue venoso in anticoagulante citrato (3,2%). Aggiungere 15/1 volume di acido citrato destrosio (ACD: citrato trisodico 80 mM, 52 mM acido citrico e 183 mM glucosio) nel sangue. Centrifugare a 350 x g senza freno per 1…

Representative Results

Per studiare l’adesione del leucocita endoteliale, cellule THP-1 fluorescente identificate sono state irrorate sopra un monostrato endoteliale TNFα o non stimolato per 2 min a 3 dyne/cm2. Il numero totale delle cellule monocytic aderenti era risoluto dopo 2 min di aspersione catturando 6 campi indipendenti per un periodo di 2-6 min. Le celle aderenti sono state quantificate in almeno 6 immagini catturate con un microscopio a contrasto/fluorescenza invertito fase (ad es.</e…

Discussion

Questo test in vitro è un semplice metodo per indagare i meccanismi di reclutamento leucocitario durante l’infiammazione vascolare, ma ci sono alcuni punti critici deve essere notato. Il primo requisito per eseguire correttamente questo dosaggio è la perfusione dei leucociti sopra un intatto e confluenti vascolari o monostrato di piastrine. Questo può essere ottenuto previo rivestimento delle superfici con collagene di tipo I. In generale, quando si lavora con cellule primarie vascolari, è importante staccar…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ringraziamo la d. ssa Martin M. Schmitt e linea Fraemohs. Questo lavoro è stato supportato dalla Fondazione Paesi Bassi per la ricerca scientifica (ZonMW VIDI 016.126.358, Landsteiner Fondazione per la ricerca di trasfusione di sangue (LSBR Nr. 1638) e Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB1123/A2) assegnato a r.r.k.

Materials

Inverted fluorescence microscope e.g. EVOS-FL Life Technologies Europe bv
Pump e.g. model: 210-CE  world precision instruments 78-9210W
Falcon 35 mm TC-Treated Easy-Grip Style Cell Culture Dish corning 353001
50 mL syringe Becton Dickinson 300137
Silicone tubing  VWR 228-0700
Elbow Luer Connector Male Ibidi 10802
Female Luer Lock Coupler Ibidi 10823
Flow chamber University Hospital RWTH Aachen Patent DE10328277A1: Baltus T, Dautzenberg R, Weber CPD. Strömungskammer zur in-vitro-Untersuchung von physiologischen Vorgängen an Zelloberflächen. 2005. 
Ibidi sticky slide VI 0.4 Ibidi 80608
Coverslips for sticky slides  Ibidi 10812
Collagen Type I, rat tail Life Technologies Europe bv A1048301
Recombinant Human TNF-α Peprotech 300-01A
Thrombin Receptor Activator for Peptide 6 (TRAP – 6) Anaspec / Eurogentec 24191
SYTO 13 green fluorescent nucleic acid stain Life Technologies Europe bv S7575
Hanks’ Balanced Salt Solution 10x Sigma-Aldrich Chemie H4641
HEPES buffer solution 1M, liquid Life Technologies Europe bv 15630049
BUMINATE Albumin, 25%  Baxter 60010
Water for injection B. Braun 3624315
Calcium chloride dihydrate Merck 102382 
Magnesium chloride hexahydrate  Sigma-Aldrich Chemie M2670
Apyrase Sigma-Aldrich Chemie A6535
Primary Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC) Promocell GmbH C-12203
Endothelial Cell Growth Medium (Ready-to-use) Promocell GmbH C-22010
Primary Human Aortic Endothelial Cells (HAoEC) ATCC  PCS-100-011
Vascular Cell Basal Medium  ATCC PCS-100-030
Endothelial Cell Growth Kit-BBE ATCC PCS-100-040
Primary Human Aortic Smooth Muscle Cells (HAoSMC) ATCC PCS-100-012
Vascular Smooth Muscle Cell Growth Kit ATCC PCS-100-042
Human endothelial cell line, EA.hy926 ATCC CRL-2922
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) ATCC 30-2002
Mouse endothelial cell line, SV 40 transformed (SVEC4-10) ATCC CRL-2181
Human Monocytic cell line, THP-1 DSMZ ACC-16
RPMI 1640 with Ultra-Glutamine Lonza BE12-702F/U1
Mouse monocyte/macrophage RAW264.7 ATCC TIB-71
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), high glucose Gibco 11965092
Accutase Promocell GmbH C-41310
Percoll Sigma-Aldrich Chemie P1644
Histopaque 1119 Sigma-Aldrich Chemie 11191
10x PBS Life Technologies Europe bv 14200075
BD Vacutainer Plastic Blood Collection Tubes with Sodium Heparin Becton Dickinson 367876
VACUETTE TUBE 9 ml 9NC Coagulation sodium citrate 3.2%  Greiner Bio 455322
HCl/EtOH mixture (1.2 mol/L HCl and 50% ethanol) in water Sigma-Aldrich Chemie Prepare by mixing 0.3L HCl (4 mol/L) with 0.7L of 70% v/v ethanol in a fume hood

References

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Vajen, T., Heinzmann, A. C., Dickhout, A., Zhao, Z., Nagy, M., Heemskerk, J. W., Koenen, R. R. Laminar Flow-based Assays to Investigate Leukocyte Recruitment on Cultured Vascular Cells and Adherent Platelets. J. Vis. Exp. (134), e57009, doi:10.3791/57009 (2018).

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