Summary

На основе ламинарного потока Assays расследовать лейкоцита набора на искусственный сосудистый клетки и сторонником тромбоцитов

Published: April 09, 2018
doi:

Summary

Лейкоциты жадно взаимодействуют с сосудистой лейкоцитов и тромбоцитов после травмы судно стены или во время воспаления. Здесь мы опишем простой ламинарного потока на основе анализа характеризовать молекулярные механизмы, которые лежат в основе взаимодействия между лейкоцитов и их партнерами по сотовой.

Abstract

Набор лейкоцитов после травмы или воспаления сайты травмы или повреждения тканей была исследована в последние десятилетия и привело к концепции Каскад адгезии лейкоцитов. Однако точные молекулярные механизмы, участвующие в лейкоцитарной набора еще определены не полностью. Поскольку набор лейкоцита остается важным вопросом в области инфекции, воспаления и иммунных исследований (авто-), мы представляем простой ламинарного потока на основе анализа для изучения основных механизмов адгезии, де адгезии, и трансмиграции лейкоцитов при венозной и артериальной потока режимах. В vitro assay может использоваться для изучения молекулярных механизмов, которые лежат в основе взаимодействия между лейкоцитов и их клеточных партнерами в различных моделях сосудистого воспаления. Этот протокол описывает ламинарного потока на основе анализа, используя камеру параллель потока и инвертированным микроскопом контраст фазы, подключен к камере для изучения взаимодействия лейкоциты и эндотелиальных клеток или тромбоциты, которые могут быть визуализированы и зарегистрированы то проанализированы в автономном режиме. Эндотелиальные клетки, тромбоциты или лейкоциты могут быть предварительно обработанных с ингибиторами или антител для определения роли конкретных молекул в ходе этого процесса. Сдвига условия, т.е. артериальной или венозной касательное напряжение, может быть легко адаптирована по вязкости и расхода жидкости перфузии и высота канала.

Introduction

После травмы, воспаление или инфекция лейкоциты быстро реагировать на возбудителя – или повреждения связанные молекулярные модели (PAMPs, DAMPs), изменения в активированное состояние и выбраться поток крови к местам воспаления и тканей повреждения. Лейкоциты способность взаимодействовать с их клеточном и молекулярном окружающей среды имеет важное значение для их правильной работы как иммунные клетки, как подчеркнул генетических расстройств, таких как дефицит адгезии лейкоцитов1. Лейкоцитарной адгезии был предметом интенсивных исследований в течение последних десятилетий, и это привело к концепции Каскад адгезии лейкоцитов в начале 1990-х2,3. Лейкоцитарной адгезии инициируется селектина посредничестве захвата лейкоциты эндотелия, вызывая клеток для пролонгировать поверхности сосудов. Это подвижного позволяет лейкоцитов для проверки эндотелий прыгните мигрирующих подсказки, например, chemokines, которые вызывают активацию интегринов. Впоследствии активированные интегринов посредником привязки эндотелиальных лигандами, результате фирмы лейкоцита ареста. Лейкоциты могут впоследствии подготовиться к extravasate ползать и распространение, перед прорезывать эндотелиальной монослоя и пролетный в основной ткани. Основная концепция канонической лейкоцита Каскад остается практически неизменной с момента ее введения, с некоторые промежуточные шаги добавил4. Тем не менее точные молекулярные механизмы и роли многих игроков, участвующих в лейкоцитарной найма не выяснены до настоящего времени, и лейкоцитарной набор остается важным вопросом в области инфекции, воспаления и (авто-) иммунной исследования.

Например во время сосудистый воспалительных заболеваний как атеросклероз, увеличилась лейкоцита вербовки в развитие зубного налета диски судна стены. Нестабильные атеросклеротических бляшек может разрыва, привело к массовым активации тромбоцитов и свертывающей системы и впоследствии окклюзии сосуда5. Это может привести к тяжелой сердечно-сосудистые исходы, такие как инфаркт миокарда или инсульт. Кроме того эндотелиальных денудации как она возникает клинически, например после стентирования коронарных артерий, приводит к множество взаимодействий лейкоцитов и тромбоцитов до внутренней стены подвергается сосуд (например, матрица компоненты и гладкой мышечных клеток) и лейкоцитов с тромбоцитов, охватывающих сосудистых повреждений. Эти взаимодействия имеют важное значение для дальнейшего развития этого заболевания как Моноцит тромбоцитов взаимодействия может управлять neointima формирования6,7. Кроме того тромбоцитов и лейкоцитов взаимодействия при посредничестве Интегрин лейкоцита Mac-1 (αMβ2) и тромбоцитов GPIbα недавно были определены как Роман драйвера тромбоза в мышей8.

Учитывая широкую доступность крови человека и животных как источник лейкоцитов и тромбоцитов исследований, и широкий спектр изолированных матрица молекул и увековечен клеточных линий лейкоцитов и сосудистого происхождения, это возможно для имитации лейкоцитов взаимодействие в поток в лаборатории установки, используя специально разработанные потока перфузии камер. Многие варианты были разработаны за последние десятилетия, начиная от вакуум driven самоклеящиеся перфузии камер. Все варианты имеют в общем, которые неподвижной части (например, искусственный сосудистый клетки или матрица белков) собираются в больших герметичным камеру с предварительно определенный канал включение перфузии жидкости над неподвижной части. Кроме того прогресс в технологии формования включена разработка заказных решений на основе силики полимеров9. Главным образом определить касательное напряжение характеристики потока перфузии устройство10вязкости и расхода жидкости перфузии и высота канала. В этой статье мы представляем в vitro метод для изучения основных механизмов адгезии, снижения адгезии и переселение лейкоцитов при венозной и артериальной потока режимах. Преимущество методов, представленные здесь заключается в том, что они могут быть выполнены с использованием общей микроскоп камера подключена флуоресценции и не требуют экспериментаторов обладают высокой технической квалификации. В пробирке можно манипулировать во многих отношениях (например, путем добавления ингибиторы или блокирование антитела) и таким образом является применимым в различных моделях сосудистого воспаления и позволяет исследование адгезии функций белков или Оценка конкретных соединений.

Protocol

Все методы, описанные здесь были одобрены медицинской этики и животных этические советы Маастрихтского университета. 1. на основе потока проба с клеток человека Изоляция тромбоцитов крови человека Нарисуйте венозной крови в антикоагулянтом цитрат (3…

Representative Results

Для изучения эндотелиальной лейкоцитарной адгезии, дневно обозначенные THP-1 клетки были увлажненную над TNFα – или не стимулирует эндотелиальной монослоя за 2 мин на 3 Дин/см2. Общее количество адэрентных клеток monocytic был определен после 2 мин перфузии, захватив 6 нез?…

Discussion

Этот assay в vitro простой метод для изучения основных механизмов найма лейкоцитов во время сосудистого воспаления, но есть некоторые критические точки следует отметить. Первым требованием для успешного выполнения этот assay является перфузии лейкоциты над нетронутыми и вырожденная со?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Мы благодарим Drs. Мартин м. Шмитт и линии Fraemohs. Эта работа была поддержана Нидерландского фонда научных исследований (ВиДи ZonMW 016.126.358, Ландштайнер Фонд исследований переливания крови (LSBR Nr. 1638) и Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB1123/A2) присуждена R.R.K.

Materials

Inverted fluorescence microscope e.g. EVOS-FL Life Technologies Europe bv
Pump e.g. model: 210-CE  world precision instruments 78-9210W
Falcon 35 mm TC-Treated Easy-Grip Style Cell Culture Dish corning 353001
50 mL syringe Becton Dickinson 300137
Silicone tubing  VWR 228-0700
Elbow Luer Connector Male Ibidi 10802
Female Luer Lock Coupler Ibidi 10823
Flow chamber University Hospital RWTH Aachen Patent DE10328277A1: Baltus T, Dautzenberg R, Weber CPD. Strömungskammer zur in-vitro-Untersuchung von physiologischen Vorgängen an Zelloberflächen. 2005. 
Ibidi sticky slide VI 0.4 Ibidi 80608
Coverslips for sticky slides  Ibidi 10812
Collagen Type I, rat tail Life Technologies Europe bv A1048301
Recombinant Human TNF-α Peprotech 300-01A
Thrombin Receptor Activator for Peptide 6 (TRAP – 6) Anaspec / Eurogentec 24191
SYTO 13 green fluorescent nucleic acid stain Life Technologies Europe bv S7575
Hanks’ Balanced Salt Solution 10x Sigma-Aldrich Chemie H4641
HEPES buffer solution 1M, liquid Life Technologies Europe bv 15630049
BUMINATE Albumin, 25%  Baxter 60010
Water for injection B. Braun 3624315
Calcium chloride dihydrate Merck 102382 
Magnesium chloride hexahydrate  Sigma-Aldrich Chemie M2670
Apyrase Sigma-Aldrich Chemie A6535
Primary Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC) Promocell GmbH C-12203
Endothelial Cell Growth Medium (Ready-to-use) Promocell GmbH C-22010
Primary Human Aortic Endothelial Cells (HAoEC) ATCC  PCS-100-011
Vascular Cell Basal Medium  ATCC PCS-100-030
Endothelial Cell Growth Kit-BBE ATCC PCS-100-040
Primary Human Aortic Smooth Muscle Cells (HAoSMC) ATCC PCS-100-012
Vascular Smooth Muscle Cell Growth Kit ATCC PCS-100-042
Human endothelial cell line, EA.hy926 ATCC CRL-2922
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) ATCC 30-2002
Mouse endothelial cell line, SV 40 transformed (SVEC4-10) ATCC CRL-2181
Human Monocytic cell line, THP-1 DSMZ ACC-16
RPMI 1640 with Ultra-Glutamine Lonza BE12-702F/U1
Mouse monocyte/macrophage RAW264.7 ATCC TIB-71
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), high glucose Gibco 11965092
Accutase Promocell GmbH C-41310
Percoll Sigma-Aldrich Chemie P1644
Histopaque 1119 Sigma-Aldrich Chemie 11191
10x PBS Life Technologies Europe bv 14200075
BD Vacutainer Plastic Blood Collection Tubes with Sodium Heparin Becton Dickinson 367876
VACUETTE TUBE 9 ml 9NC Coagulation sodium citrate 3.2%  Greiner Bio 455322
HCl/EtOH mixture (1.2 mol/L HCl and 50% ethanol) in water Sigma-Aldrich Chemie Prepare by mixing 0.3L HCl (4 mol/L) with 0.7L of 70% v/v ethanol in a fume hood

References

  1. Dinauer, M. C. Primary immune deficiencies with defects in neutrophil function. American Society of Hematology. 2016 (1), 43-50 (2016).
  2. Butcher, E. C. Leukocyte-endothelial cell recognition: three (or more) steps to specificity and diversity. Cell. 67 (6), 1033-1036 (1991).
  3. Springer, T. A. Traffic signals for lymphocyte recirculation and leukocyte emigration: the multistep paradigm. Cell. 76 (2), 301-314 (1994).
  4. Nourshargh, S., Alon, R. Leukocyte migration into inflamed tissues. Immunity. 41 (5), 694-707 (2014).
  5. Legein, B., Temmerman, L., Biessen, E. A. L., Lutgens, E. Inflammation and immune system interactions in atherosclerosis. Cellular and Molecular Life Sciences. 70 (20), 3847-3869 (2013).
  6. Wang, Y., Sakuma, M., et al. Leukocyte engagement of platelet glycoprotein Ibalpha via the integrin Mac-1 is critical for the biological response to vascular injury. Circulation. 112 (19), 2993-3000 (2005).
  7. Zhao, Z., Vajen, T., et al. Deletion of junctional adhesion molecule A from platelets increases early-stage neointima formation after wire injury in hyperlipidemic mice. Journal of cellular and molecular medicine. , (2017).
  8. Wang, Y., Gao, H., et al. Leukocyte integrin Mac-1 regulates thrombosis via interaction with platelet GPIbα. Nature communications. 8, 15559 (2017).
  9. Fujii, T. PDMS-based microfluidic devices for biomedical applications. Microelectronic Engineering. 61-62, 907-914 (2002).
  10. Son, Y. Determination of shear viscosity and shear rate from pressure drop and flow rate relationship in a rectangular channel. Polymer. 48 (2), 632-637 (2007).
  11. Brinkmann, V., Laube, B., Abu Abed, U., Goosmann, C., Zychlinsky, A. Neutrophil extracellular traps: how to generate and visualize them. Journal of visualized experiments : JoVE. (36), e1724 (2010).
  12. Swamydas, M., Lionakis, M. S. Isolation, purification and labeling of mouse bone marrow neutrophils for functional studies and adoptive transfer experiments. Journal of visualized experiments : JoVE. (77), e50586 (2013).
  13. Schmitt, M. M. N., Megens, R. T. A., et al. Endothelial junctional adhesion molecule-a guides monocytes into flow-dependent predilection sites of atherosclerosis. Circulation. 129 (1), 66-76 (2014).

Play Video

Cite This Article
Vajen, T., Heinzmann, A. C., Dickhout, A., Zhao, Z., Nagy, M., Heemskerk, J. W., Koenen, R. R. Laminar Flow-based Assays to Investigate Leukocyte Recruitment on Cultured Vascular Cells and Adherent Platelets. J. Vis. Exp. (134), e57009, doi:10.3791/57009 (2018).

View Video