लामिना प्रवाह आधारित परख ल्युकोसैट की जांच करने के लिए प्रसंस्कृत संवहनी कोशिकाओं और अनुयाई प्लेटलेट्स पर भर्ती
Summary
ल्यूकोसाइट्स avid के पोत दीवार चोट के बाद या सूजन के दौरान संवहनी कोशिकाओं और प्लेटलेट्स के साथ बातचीत । यहां, हम एक सीधा लामिना प्रवाह का वर्णन आधारित परख के लिए आणविक तंत्र है कि आबाद ल्यूकोसाइट्स और उनके सेलुलर भागीदारों के बीच बातचीत की विशेषताएं ।
Abstract
चोट या चोट या ऊतक क्षति की साइटों के लिए सूजन पर ल्यूकोसाइट्स की भर्ती हाल के दशकों के दौरान जांच की गई है और ल्युकोसैट आसंजन झरना की अवधारणा में हुई है । हालांकि, ल्युकोसैट भर्ती में शामिल सटीक आणविक तंत्र अभी पूरी तरह पहचाने नहीं गए हैं । चूंकि ल्युकोसैट भर्ती संक्रमण, सूजन, और (ऑटो) प्रतिरक्षा अनुसंधान के क्षेत्र में एक महत्वपूर्ण विषय रहता है, हम एक सीधा लामिना प्रवाह आधारित परख के लिए आसंजन, de-आसंजन के अंतर्निहित तंत्र का अध्ययन वर्तमान, और शिरापरक और धमनी प्रवाह शासन के तहत ल्यूकोसाइट्स के स्थानांतरगमन । इन विट्रो परख आणविक तंत्र है कि आबाद संवहनी सूजन के विभिंन मॉडलों में ल्यूकोसाइट्स और उनके सेलुलर भागीदारों के बीच बातचीत का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । इस प्रोटोकॉल का वर्णन एक लामिना प्रवाह एक समानांतर प्रवाह कक्ष और एक औंधा चरण कंट्रास्ट एक कैमरे से जुड़े माइक्रोस्कोप का उपयोग करने के लिए ल्यूकोसाइट्स और endothelial कोशिकाओं या प्लेटलेट्स की बातचीत का अध्ययन है, जो कल्पना और दर्ज किया जा सकता है तो-परख आधारित ऑफ़लाइन विश्लेषण किया गया । Endothelial कोशिकाओं, प्लेटलेट्स, या ल्यूकोसाइट्स अवरोधकों या एंटीबॉडी के साथ इस प्रक्रिया के दौरान विशिष्ट अणुओं की भूमिका निर्धारित करने के लिए इलाज किया जा सकता है । कतरनी की स्थिति, यानी धमनी या शिरापरक कतरनी तनाव, आसानी से perfused तरल पदार्थ और चैनल की ऊंचाई चिपचिपापन और प्रवाह की दर से अनुकूलित किया जा सकता है ।
Introduction
चोट, सूजन, या संक्रमण पर, ल्यूकोसाइट्स जल्दी से रोगज़नक़ का जवाब-या नुकसान-आणविक पैटर्न (PAMPs, नम), एक सक्रिय राज्य में परिवर्तन, और रक्त प्रवाह के बाहर सूजन और ऊतक क्षति की साइटों के लिए कदम । ल्यूकोसाइट्स की क्षमता उनके सेलुलर और आणविक वातावरण के साथ बातचीत करने के लिए प्रतिरक्षा कोशिकाओं के रूप में उनके सही कार्य के लिए आवश्यक है, के रूप में आनुवंशिक विकारों द्वारा इस तरह के रूप में प्रकाश डाला ल्युकोसैट आसंजन की कमी1. ल्युकोसैट आसंजन पिछले दशकों के दौरान गहन जांच का विषय रहा है और यह 1990 के दशक2,3में ल्युकोसैट आसंजन झरना की अवधारणा में हुई है । ल्युकोसैट आसंजन endothelium करने के लिए ल्यूकोसाइट्स की selectin मध्यस्थता कब्जा द्वारा शुरू की है, कोशिकाओं संवहनी सतह पर रोल करने के लिए कारण. इस रोलिंग ल्यूकोसाइट्स endothelium-बाध्य प्रवासी cues, के लिए स्कैन करने के लिए सक्षम बनाता है, जैसे, chemokines, जो integrins के सक्रियण प्रेरित । इसके बाद, सक्रिय integrins मध्यस्थता endothelial लाइगैंडों करने के लिए बाध्यकारी, जिसके परिणामस्वरूप फर्म ल्युकोसैट गिरफ्तारी. ल्यूकोसाइट्स बाद में रेंगने और प्रसार, endothelial monolayer और transmigrating अंतर्निहित ऊतक में मर्मज्ञ से पहले extravasate करने के लिए तैयार कर सकते हैं । विहित ल्युकोसैट झरना की मूल अवधारणा अपने परिचय के बाद से मोटे तौर पर अपरिवर्तित बनी हुई है, कुछ मध्यवर्ती चरणों के साथ4जोड़ा गया । फिर भी, सटीक आणविक तंत्र और ल्युकोसैट भर्ती में शामिल कई खिलाड़ियों की भूमिकाओं को इस प्रकार अब तक स्पष्ट नहीं किया गया है, और ल्युकोसैट भर्ती संक्रमण, शोथ, और (ऑटो) प्रतिरक्षा के क्षेत्र में एक महत्वपूर्ण विषय बनी हुई है अनुसंधान.
उदाहरण के लिए, atherosclerosis के रूप में संवहनी भड़काऊ रोगों के दौरान, पोत दीवार ड्राइव पट्टिका विकास में वृद्धि हुई ल्युकोसैट भर्ती । अस्थिर atherosclerotic पट्टिका टूटना, प्लेटलेट्स और जमावट प्रणाली के बड़े पैमाने पर सक्रियण के लिए अग्रणी हो सकता है, और बाद में पोत के रोड़ा के लिए5। इस तरह के रोधगलन या स्ट्रोक के रूप में गंभीर हृदय परिणामों में परिणाम हो सकता है । इसके अलावा, endothelial अनाच्छादन के रूप में यह नैदानिक होता है, एक कोरोनरी धमनी के स्टेंटिंग के बाद उदा , उजागर पोत दीवार इंटीरियर के लिए ल्यूकोसाइट्स और प्लेटलेट्स की बातचीत की एक भीड़ की ओर जाता है (उदा, मैट्रिक्स घटकों और चिकनी मांसपेशी कोशिकाओं) और प्लेटलेट्स संवहनी चोट को कवर के साथ ल्यूकोसाइट्स की । ये बातचीत monocyte-प्लेटलेट बातचीत neointima गठन6,7ड्राइव हो सकता है के रूप में रोग के आगे विकास के लिए महत्वपूर्ण हैं । इसके अलावा, प्लेटलेट ल्युकोसैट ल्युकोसैट integrin मैक-1 (αएमβ2) और प्लेटलेट GPIbα द्वारा मध्यस्थता हाल ही में चूहों8में घनास्त्रता के उपंयास ड्राइवरों के रूप में पहचान की गई है ।
अनुसंधान के लिए ल्यूकोसाइट्स और प्लेटलेट्स के एक स्रोत के रूप में मानव और पशु रक्त की व्यापक उपलब्धता को देखते हुए, और अलग मैट्रिक्स अणुओं की व्यापक स्पेक्ट्रम और ल्युकोसैट और संवहनी मूल के अमर कोशिका लाइनों, यह अनुकरण करने के लिए व्यवहार्य है ल्युकोसैट एक प्रयोगशाला की स्थापना में प्रवाह के तहत बातचीत, विशेष रूप से डिजाइन प्रवाह छिड़काव कक्षों का उपयोग कर । कई वेरिएंट पिछले दशकों में डिजाइन किया गया है, वैक्यूम से लेकर स्वयं चिपकने वाला छिड़काव कक्षों के लिए प्रेरित । सभी वेरिएंट आम में है कि मोबाइल हिस्सा (जैसे, प्रसंस्कृत संवहनी कोशिकाओं या मैट्रिक्स प्रोटीन) एक बड़ा रिसाव-सबूत एक पूर्व परिभाषित चैनल के साथ सुसज्जित कक्ष में इकट्ठे हुए है एक से अधिक तरल पदार्थ के छिड़काव सक्षम करने के लिए । इसके अतिरिक्त, मोल्डिंग प्रौद्योगिकी में अग्रिमों ने सिलिका पॉलीमर्स9के आधार पर कस्टम-निर्मित समाधानों के विकास को सक्षम किया । चिपचिपाहट और प्रवाह की दर perfused तरल पदार्थ और चैनल की ऊंचाई मुख्य रूप से प्रवाह छिड़काव डिवाइस की कतरनी तनाव विशेषताओं का निर्धारण10। इस अनुच्छेद में, हम एक इन विट्रो विधि आसंजन के अंतर्निहित तंत्र का अध्ययन करने के लिए मौजूद है, de-आसंजन, और स्थानांतरगमन के तहत ल्यूकोसाइट्स के शिरापरक और धमनी प्रवाह शासन । यहां प्रस्तुत तरीकों का लाभ यह है कि वे एक आम कैमरे से जुड़े प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप का उपयोग कर प्रदर्शन किया जा सकता है, और एक प्रयोगकर्ता उच्च तकनीकी प्रवीणता के अधिकारी की आवश्यकता नहीं है । इन विट्रो परख कई मायनों में हेरफेर किया जा सकता है (जैसे, अवरोधकों को जोड़ने या एंटीबॉडी अवरुद्ध द्वारा), और इस प्रकार संवहनी सूजन के विभिन्न मॉडलों में लागू है और आसंजन प्रोटीन कार्यों की जांच की अनुमति देता है या विशिष्ट यौगिकों का मूल्यांकन ।
Protocol
Representative Results
Discussion
इस में इन विट्रो परख एक सरल तरीका संवहनी सूजन के दौरान ल्युकोसैट भर्ती के अंतर्निहित तंत्र की जांच है, लेकिन वहां कुछ महत्वपूर्ण बिंदुओं पर ध्यान दिया जाना है । सफलतापूर्वक इस परख प्रदर्शन के लिए प?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम डीआरएस को धन्यवाद देते हैं । मार्टिन एम Schmitt और रेखा Fraemohs । इस काम के लिए नीदरलैंड फाउंडेशन द्वारा समर्थित वैज्ञानिक अनुसंधान (ZonMW विडि 016.126.358, Landsteiner फाउंडेशन रक्त आधान अनुसंधान के लिए (LSBR Nr. १६३८) और ड्यूश Forschungsgemeinschaft (SFB1123/A2) R.R.K. को संमानित किया गया
Materials
| Inverted fluorescence microscope e.g. EVOS-FL | Life Technologies Europe bv | ||
| Pump e.g. model: 210-CE | world precision instruments | 78-9210W | |
| Falcon 35 mm TC-Treated Easy-Grip Style Cell Culture Dish | corning | 353001 | |
| 50 mL syringe | Becton Dickinson | 300137 | |
| Silicone tubing | VWR | 228-0700 | |
| Elbow Luer Connector Male | Ibidi | 10802 | |
| Female Luer Lock Coupler | Ibidi | 10823 | |
| Flow chamber | University Hospital RWTH Aachen | Patent DE10328277A1: Baltus T, Dautzenberg R, Weber CPD. Strömungskammer zur in-vitro-Untersuchung von physiologischen Vorgängen an Zelloberflächen. 2005. | |
| Ibidi sticky slide VI 0.4 | Ibidi | 80608 | |
| Coverslips for sticky slides | Ibidi | 10812 | |
| Collagen Type I, rat tail | Life Technologies Europe bv | A1048301 | |
| Recombinant Human TNF-α | Peprotech | 300-01A | |
| Thrombin Receptor Activator for Peptide 6 (TRAP – 6) | Anaspec / Eurogentec | 24191 | |
| SYTO 13 green fluorescent nucleic acid stain | Life Technologies Europe bv | S7575 | |
| Hanks’ Balanced Salt Solution 10x | Sigma-Aldrich Chemie | H4641 | |
| HEPES buffer solution 1M, liquid | Life Technologies Europe bv | 15630049 | |
| BUMINATE Albumin, 25% | Baxter | 60010 | |
| Water for injection | B. Braun | 3624315 | |
| Calcium chloride dihydrate | Merck | 102382 | |
| Magnesium chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich Chemie | M2670 | |
| Apyrase | Sigma-Aldrich Chemie | A6535 | |
| Primary Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC) | Promocell GmbH | C-12203 | |
| Endothelial Cell Growth Medium (Ready-to-use) | Promocell GmbH | C-22010 | |
| Primary Human Aortic Endothelial Cells (HAoEC) | ATCC | PCS-100-011 | |
| Vascular Cell Basal Medium | ATCC | PCS-100-030 | |
| Endothelial Cell Growth Kit-BBE | ATCC | PCS-100-040 | |
| Primary Human Aortic Smooth Muscle Cells (HAoSMC) | ATCC | PCS-100-012 | |
| Vascular Smooth Muscle Cell Growth Kit | ATCC | PCS-100-042 | |
| Human endothelial cell line, EA.hy926 | ATCC | CRL-2922 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | ATCC | 30-2002 | |
| Mouse endothelial cell line, SV 40 transformed (SVEC4-10) | ATCC | CRL-2181 | |
| Human Monocytic cell line, THP-1 | DSMZ | ACC-16 | |
| RPMI 1640 with Ultra-Glutamine | Lonza | BE12-702F/U1 | |
| Mouse monocyte/macrophage RAW264.7 | ATCC | TIB-71 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), high glucose | Gibco | 11965092 | |
| Accutase | Promocell GmbH | C-41310 | |
| Percoll | Sigma-Aldrich Chemie | P1644 | |
| Histopaque 1119 | Sigma-Aldrich Chemie | 11191 | |
| 10x PBS | Life Technologies Europe bv | 14200075 | |
| BD Vacutainer Plastic Blood Collection Tubes with Sodium Heparin | Becton Dickinson | 367876 | |
| VACUETTE TUBE 9 ml 9NC Coagulation sodium citrate 3.2% | Greiner Bio | 455322 | |
| HCl/EtOH mixture (1.2 mol/L HCl and 50% ethanol) in water | Sigma-Aldrich Chemie | Prepare by mixing 0.3L HCl (4 mol/L) with 0.7L of 70% v/v ethanol in a fume hood |
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