Vi beskriver här stenos i inferior vena cava som murina modell av djup ventrombos. Denna modell recapitulates blod flöde begränsning, en av de stora triggers för ventrombos hos människor.
Djup venös trombos (DVT) och dess förödande komplikation, lungemboli, är ett allvarligt hälsoproblem med hög dödlighet. Mekanismerna av tromb bildas i venerna är fortfarande oklara. Bristen på rörlighet (t.ex., efter kirurgi eller långdistansflygningar) är en av de viktigaste faktorerna som leder till DVT. Patofysiologiska följden av bristen på rörlighet är blod flöde stagnation i venösa klaffarna. Här beskrivs en modell som härmar sådana flöde störningar som en trombos-drivande faktor. I denna modell skapas partiell flöde begränsning (stenos) i den sämre vena cava (IVC). Stängningen av ca 90% av IVC lumen för 48 h resulterar i utvecklingen av tromboser strukturellt liknar de hos människa. Likheterna är: i) de flesta av tromb volymen är röd, dvs består av röda blodkroppar och fibrin, ii) förekomsten av en vit del (linjer av Zahn), (iii) icke-utblottad endothelial enskiktslager, iv) förhöjda plasmanivåer D-Dimer och v) möjligheten att förhindra trombos av lågmolekylärt heparin. Begränsningar inkluderar variabel storlek tromboser och faktumet att en viss procentandel av vildtyp möss (0 – 35%) inte kan producera en tromb. Utöver visuell observation och mätning, kan tromboser visualiseras genom icke-invasiv teknik, såsom ultraljud, som tillåter övervakning dynamiken i tromb utveckling. Vid kortare tidpunkter (1-6 h), intravital mikroskopi kan tillämpas för att direkt observera händelser (t.ex., rekrytering av celler till kärlväggen) föregår tromb bildas. Användning av denna metod av flera team runt om i världen har gjort det möjligt att avslöja grundläggande mekanismer DVT insättande och identifiera potentiella mål som kan vara till nytta för att förebygga.
Djup ventrombos (DVT) är utvecklingen av tromboser i djupa vener, vanligtvis (men inte bara) i benen. I Konjunktioner med lungemboli (PE; designerat tillsammans som venös tromboembolism, VTE) det framkallar i ungefärligt 900.000 amerikaner årligen och utgör en allvarlig hälsofråga och ekonomiskt problem1,2. PE, en komplikation av DVT, uppstår när en tromb blir fristående från dess ursprungliga plats och når lungorna, vilket kan orsaka andningsinsufficiens och död. Dödssiffran från VTE överskrider dödligheten i AIDS, breast cancer och trafikolyckor, kombinerade3.
Den viktigaste faktorn som orsakar DVT förutom är kända skäl, såsom cancer eller trauma, bristen på rörlighet 4,5. Detta kan resultera från kirurgi (särskilt ortopediska), förlamning, långdistansflygningar eller andra skäl. Blodflödet i venerna beror på muskelpump och därför lem immobilisering resultat i stillastående blod flöde i venösa klaffarna, vilket leder till Trombos. Syftet med den metod som beskrivs häri är att sammanfatta sådant blod flöde distorsion6,7. Delflöde begränsning i den sämre vena cava (IVC) härmar villkor skapade i mänskliga venösa klaffarna och resulterar i bildandet av en tromb liknande struktur som människans tromboser6. Den stora delen av en tromb är röd och består av införlivandet av blodplättar, röda blodkroppar och fibrin. Tromboser har en liten ”vita delen” berikad i trombocyter (figur 1), som liknar ”rader med Zahn” som beskrivs i mänskliga venösa tromboser. Båda delarna av tromben innehåller också neutrofiler8, som är bland de första cellerna ska rekryteras på platsen för framtida tromb6,9. Neutrofiler i den röda delen utvisa neutrofila extracellulära fällor (nät), medan neutrofiler i den vita delen verkar sakna nät8. Likaså att mänskliga DVT åtföljs trombos hos möss av förhöjda plasmanivåer D-dimer (figur 2). Lågmolekylärt heparin (enoxaparin), används för DVT profylax hos patienter, förhindrar också trombos hos möss. En viktig fördel med denna metod är avsaknad av endothelial denudation9, vilket är karaktäristiskt för mänskliga DVT10. Denna funktion gör IVC stenos en mer kliniskt relevant modell av DVT än, till exempel induktion av trombos av järnklorid, som inducerar endotelial denudation och där tromboser består huvudsakligen av trombocyter11, 12,13. En modell av komplett Stas i IVC föredras av flera lag14,15,16. I motsats till stenos, där kvarstående flöde underhålls i fartyget, tillämpning av stasis stoppar helt flödet och därmed begränsar tillgängligheten till systemiskt administrerade substanser till webbplatsen trombos. Det verkar också att mekanismerna bakom trombos som induceras av stenos och stasis är olika: stenos resulterar i utvecklingen av lokal inflammation (aktivering av endotel, frisläppandet av Weibel-Palade kropp innehåll, rekrytering av immunceller och trombocyter att kärlväggen) orsakar ”immunothrombosis”6,9,17, stasis förefaller att inducera snarare trombos utifrån, i synnerhet vävnadsfaktor och andra koagulering och fibrinolys-relaterade mekanismer18,19,20. Således, stenos och stasis modellerna återspeglar lite olika aspekter av venös trombos utveckling, även om deras mekanismer kan säkerligen överlappa. Elektrolytisk IVC modell (EIM) DVT21,22 inducerar en tromb som endast delvis occluding kärlväggen. Därför är det bekvämt för att testa effekterna av systemisk administrering av olika droger på tromb tillväxt. Denna modell, förutsätter dock störningar av IVC vägg integritet (infogning av en nål) och induktion av trombos av elektrisk ström att göra patofysiologiska relevansen av denna mekanism minst omtvistat.
Här, presenteras ett protokoll av den IVC stenos, som härmar blod flöde distorsion, en viktig utlösande faktor för DVT. Stenos i IVC inducerar utveckling av tromboser i 65-100% av C57BL/6 möss inom 48 h och 25-50% av möss inom 2-6 h6,8,23 (Brill A, opublicerade data, 2016). En stor begränsning för metoden är variationerna i tromb storlek24 (figur 4), som kan observeras efter både kortsiktiga (6 h) och långsiktiga (48 h) IVC stenos. Skälen för sådana variabilitet (med tanke på att samma villkor, såsom distansen, anestesi osv, används) förblir dunkla men man kan spekulera att Anatomiska variationer mellan möss (t.ex. bredd av IVC, antalet och placeringen av både sida och tillbaka grenar) ligger bakom detta fenomen. Variabiliteten i tromb storlek gör trombos förekomsten (procent av möss med en tromb) det viktigaste resultatet. Trombos prevalensen kan jämföras med oförutsedda bord och Fishers exakta test. Ett av experimenten var ett undantag när reducerade tromb storlek med samma trombos förekomsten efter injektion av podoplanin-hämmande antikroppar observerades 7.
Denna metod är särskilt användbart när venös trombos inledande studeras. Det möjliggör utreda tidiga händelser i kärlväggen, såsom rekrytering av celler, leder så småningom till Trombos. Pro – eller anti – thrombotic effekterna av droger kan utvärderas med hjälp av denna modell med trombos prevalens är en primär avläsning. Stenos för 48 h är tillämpligt att avslöja en anti-trombotisk fenotyp, medan 6 h stenos kan användas om en protrombotiska fenotyp förväntas. Histologisk analys av tromb och omgivande IVC vägg kan också utföras.
Frågan huruvida sida grenar bör vara sammanskrivna eller kvar patent förblir öppen. En grupp har visat att ligering av sidogrenar ökar inte tromb storlek och läge av en side-gren närmare än 1,5 mm till webbplatsen IVC ligering dramatiskt försämrar tromb utveckling25. Stängningen av sidogrenar kan framkalla endoteliala skador i dem och även öka tiden för kirurgi26. I våra händer minskar bristen på sida gren stängning avsevärt trombos prevalens (ned till 10-30% efter 48 h stenos; Brill, opublicerade) och därför vi ligera alla synliga sidogrenar.
Littermate kontroller bör helst användas som möss, även på samma bakgrund men från olika källor, kan ha lite olika trombos prevalens. Om effekten av DVT sig på eventuella parametrar (till exempel, biokemisk) studeras, bör sham manövrerade djur användas. Simulerade manövrerade möss genomgå samma procedur men ligatur runt IVC är stängd löst och lämnade det utan producerar stenos.
Det vanligaste misstaget (ett kritiskt steg) i detta protokoll är ett försök att separera aorta och den IVC inte just i vinkeln mellan fartygen men något lägre, vilket oftast resulterar i blödning. När en massiv blödning inträffar, bra återhämtning av musen blir osannolikt och det rekommenderas att stoppa experimentet och avliva djuret. Normalt, möss återhämta sig väl, flytta inuti buren och väsentligen minskar inte i vikt. Vi rekommenderar möss över 20 g för både män och kvinnor och hålla djur (särskilt hanar) i enskilda burar efter operationen fram till slutet av experimentet att undvika kämpar och skada. Det har rapporterats i en annan (elektrolytisk) modell av DVT att hanmöss producerar större tromboser än honor27. Analys av våra data har inte avslöjat betydande skillnad i trombos prevalens mellan manliga och kvinnliga möss (Brill, opublicerad). Därför uppmuntras forskare att utföra experiment med IVC stenos modell på möss av båda könen.
Unravelling suturer eller häftklamrar kan inte uteslutas framför allt i långa experiment (en vecka och längre). Således, möss bör kontrolleras minst två gånger en dag speciellt för suturen integritet och särskild uppmärksamhet bör ägnas utseendemässigt av blod spår på bur sängkläder.
Det bör noteras att, liksom alla andra djur modellen, stenos av IVC har sina begränsningar när det gäller översättning till människor. Murina IVCs har till exempel inte ventiler, medan mänskliga DVT utvecklar inuti venösa klaffarna. Människor har också spinal vertikalt med muskel pumpen att vara en viktig mekanism accelererande blodflödet i venerna. Däremot har möss spinal horisontell orientering med ingen roll av muskelpump stödja blod tillbaka till hjärtat. Dessa begränsningar bör beaktas när översätta från mus till den mänskliga sjukdomen.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöds av stiftelsen brittiska hjärtat (PG/13/60/30406) och University of Birmingham.
C57BL/6 mice | Charles River | 8 – 10 weeks old, bothe genders | |
Scissors | WPI | 15922 | |
Scissors | WPI | 14003 | |
Dumont 5/45 forceps | FST | 11251-35 | |
7-0 Prolene suture | Ethicon | W8725 | |
6-0 Vicryl suture | Ethicon | W9981 | |
Cotton buds | Spar | ||
Millswabs sterile | Millpledge veterinary | 611950 | |
Drapes | Kruuse | 141765 | |
Glucose Saline-Aqupharm3 | Animal Care | XVD589 | |
Clear H20 HydroGel 98% sterile water | Clearh2o | ||
Buprenorphine | National Veterinary Supplies | ||
Isoflurane vaporizer | General Anaesthetic Services | ||
IsoFlo 100% W/W inhalation vapour, liquid | National Veterinary Supplies | ||
Sterilizer Steri350 | Inotech | ||
Microscope Olympus SZX10 | Olympus |