Análise das Interações Proteína-Proteína e Co-localização entre Componentes das Juntas Abertas, Apertadas e Aderentes nas Glândulas Mamárias Murinas

O crescimento e desenvolvimento das glândulas mamárias ocorre principalmente após o nascimento. Este órgão se remodela constantemente ao longo da vida reprodutiva de um mamífero ¹ . O epitélio da glândula mamária adulta é constituído por uma camada interna de células epiteliais luminal e uma camada externa de células basais, composta principalmente de células mioepiteliais, cercadas por uma membrana basal ² . Para uma boa revisão sobre a estrutura e desenvolvimento da glândula mamária, o leitor pode se referir ao Sternlicht ¹ . As interações célula-célula através das juntas gap (GJ), tight (TJ) e adherens (AJ) são necessárias para o desenvolvimento e função normal da glândula ^{1 , 3 , 4 , 5 , 6} . Os principais componentes dessas junções na glândula mamária murina são Cx26, Cx30, Cx32 e Cx43 (GJ); Claudin-1, -3, -4 e -7 eZO-1 (TJ); E E-caderina, P-caderina e β-catenina (AJ) ^{7 , 8} . Os níveis de expressão dessas diferentes proteínas juncionais variam de maneira dependente do estágio durante o desenvolvimento da glândula mamária, sugerindo requisitos diferenciais de interação célula-célula ⁹ . GJ, TJ e AJ estão ligados estruturalmente e funcionalmente e ligam outras proteínas estruturais ou reguladoras aos locais vizinhos de células adjacentes, criando assim um nexo juncional ¹⁰ . A composição do nexo juncional pode impactar a ponte com o citoesqueleto subjacente, bem como a permeabilidade e a estabilidade do nexo e, conseqüentemente, influenciar a função da glândula ^{8 , 9 , 10 , 11} . Os componentes das junções intercelulares que residem em nexos de junção ou interagem uns com os outros em difOs estádios de desenvolvimento do desenvolvimento da glândula mamária foram recentemente analisados ​​utilizando co-imunofluorescência (co-IF) e co-imunoprecipitação (co-IP) ⁹ . Enquanto outras técnicas permitem a avaliação da associação funcional entre proteínas, esses métodos não são apresentados neste manuscrito.

Como as proteínas apenas atuam sozinhas para funcionar, o estudo das interações proteína-proteína (IPPs), como transduções de sinais e cascatas bioquímicas, é essencial para muitos pesquisadores e pode fornecer informações significativas sobre a função das proteínas. A co-IF e a análise microscópica ajudam a avaliar algumas proteínas que compartilham o mesmo espaço subcelular. No entanto, o número de alvos é limitado pelos anticorpos, que devem ser criados em diferentes animais e pelo acesso a um microscópio confocal equipado com diferentes lasers de comprimento de onda e um detector espectral para multiplexação. O Co-IP confirma ou revela interações físicas de alta afinidade entreEen duas ou mais proteínas que residem dentro de um complexo protéico. Apesar do desenvolvimento de novas técnicas, como a transferência de energia de ressonância de fluorescência (FRET) ¹² e o ensaio de ligação de proximidade (PLA) ¹³ , que pode detectar simultaneamente a localização e as interações de proteínas, o co-IP continua sendo uma técnica apropriada e acessível para estudar interações entre Proteínas endógenas.

O método passo-a-passo descrito neste manuscrito facilitará o estudo da localização da proteína e PPIs e apontará armadilhas para evitar ao estudar PPIs endógenos nas glândulas mamárias. A metodologia começa com a apresentação dos diferentes procedimentos de preservação dos tecidos necessários para cada técnica. A Parte 1 apresenta como estudar a co-localização de proteínas em três etapas: i) o corte das glândulas mamárias, ii) a rotulagem dupla ou tripla de diferentes proteínas usando a técnica co-IF, e iii) a imagem deLocalização de proteínas. A Parte 2 mostra como precipitar uma proteína endógena e identificar suas proteínas que interagem em três etapas: i) preparação do lisado, ii) imunoprecipitação indireta da proteína e iii) identificação do parceiro de ligação por SDS-PAGE e Western blot. Cada passo deste protocolo é otimizado para os tecidos das glândulas mamárias de roedores e gera resultados de alta qualidade, específicos e reprodutíveis. Este protocolo também pode ser usado como ponto de partida para estudos de PPI em outros tecidos ou linhas celulares.