ניתוח אינטראקציות חלבון חלבון שיתוף לוקליזציה בין רכיבי פערים, צמודים, ו adherens צמתים Murine בלוטות החלב
Summary
צמתים בין-תאיים הם דרישות עבור פונקציות ספציפיות של בלוטת החלב והתפתחותן. כתב היד מספק פרוטוקול מפורט לחקר האינטראקציות בין חלבונים לחלבון (PPI) לבין שיתוף לוקליזציה באמצעות בלוטות החלב Murine. טכניקות אלה מאפשרות לחקור את הדינמיקה של הקשר הפיזי בין צמתים בין-תאיים בשלבי התפתחות שונים.
Abstract
אינטראקציות תא סלולרי תפקיד מרכזי בשמירה על שלמות הרקמה ואת המכשול בין תאים שונים של בלוטת החלב. אינטראקציות אלה מסופקות על ידי חלבונים גנטיים המרכיבים נקסוס בין תאים סמוכים. מיצוקלציה של חלבון פונקציונאלי וירידה באסוציאציות פיזיות עם השותפים המחייבים שלהם עלולה לגרום לאובדן תפקוד, וכתוצאה מכך לתפקוד איברים. לכן, זיהוי לוקליזציה של חלבונים וחלבוני חלבונים (PPI) ברקמות הרגילות והמחלות, חיוניים למציאת עדויות ומנגנונים חדשים המביאים להתפתחות מחלות או שינויים במעמד ההתפתחותי. כתב היד מציג שיטה דו-שלבית להערכת PPIs בבלוטות החלב של Murine. בפרוטוקול סעיף 1, שיטה לבצע co- אימונופלורסנציה (שיתוף IF) באמצעות נוגדנים שהועלו נגד חלבונים של עניין, ואחריו נוגדנים משניים שכותרתו עם fluorochromes, מתואר. למרות שיתוף שיתוף IFבגלל ההוכחה של קרבת החלבונים, היא מאפשרת ללמוד את האינטראקציות הגופניות שלהם. לכן, פרוטוקול מפורט עבור שיתוף immunoprecipitation (שיתוף IP) מסופק בסעיף פרוטוקול 2. שיטה זו משמשת כדי לקבוע את האינטראקציות הגופניות בין חלבונים, מבלי לאשר אם אינטראקציות אלה הן ישירות או עקיפות. בשנים האחרונות, Co-IF ו- co-IP טכניקות הוכיחו כי רכיבים מסוימים של צמתים בין תאגידים שיתוף וליצור אינטראקציה יחד, יצירת תלויי שלב nexuses הגדילה המשתנים במהלך התפתחות בלוטת החלב.
Introduction
התפתחות בלוטת החלב ופיתוח מתרחשת בעיקר לאחר הלידה. איבר זה מתחדד ללא הרף לאורך כל חיי הפוריות של יונק 1 . האפיתל בבלוטת החלב הבוגרת מורכבת משכבה פנימית של תאי אפיתל לומינליים ושכבה חיצונית של תאים ביזליים, המורכבים בעיקר מתאי מיופתיטליים, מוקפים בקרום מרתף 2 . לבדיקה טובה על מבנה בלוטת החלב ופיתוח, הקורא יכול להתייחס Sternlicht 1 . תאים תא אינטראקציות דרך הפער (GJ), הדוק (TJ), והצמדות (AJ) צמתים הדרושים להתפתחות תקינה ותפקוד של בלוטה 1 , 3 , 4 , 5 , 6 . המרכיבים העיקריים של צמתים אלה בלוטת החלב Murine הם Cx26, Cx30, Cx32, ו Cx43 (GJ); קלודין -1, -3, -4, -7 וZO-1 (TJ); ו E-cadherin, P-cadherin, ו β-catenin (AJ) 7 , 8 . רמות הביטוי של אלה חלבונים ג 'וניקט שונים להשתנות באופן תלוי שלב במהלך התפתחות בלוטת החלב, מה שמציע אינטראקציה תא תא אינטראקציה הדרישות 9 . GJ, TJ ו- AJ קשורים באופן מבניים ופונקציונליים ומקיפים חלבונים מבניים או רגולטוריים אחרים לאתרים הסמוכים של תאים סמוכים, ובכך יוצרים קשר גנטי. ההרכב של הקשר הג'ונקטי יכול להשפיע על גישור עם cytoskeleton הבסיסית, כמו גם חדירות ויציבות nexus, ולכן יכול להשפיע על הפונקציה של בלוטת 8 , 9 , 10 , 11 . המרכיבים של צמתים בין תאים המתגוררים nexuses פונקציונלי או אינטראקציה אחד עם השני ב difבשלבים התפתחותיים של התפתחות בלוטת החלב נותחו לאחרונה באמצעות שיתוף immunofluorescence (שיתוף IF) ושיתוף אימונופרסיפיטיון (שיתוף IP) 9 . בעוד טכניקות אחרות מאפשרות להעריך את הקשר הפונקציונלי בין חלבונים, שיטות אלו אינן מוצגות בכתב היד הזה.
כאשר חלבונים פועלים רק לבדם לתפקוד, לימוד אינטראקציות בין חלבונים לחלבון (PPI), כגון טרנספורמציות אותות ומפליות ביוכימיות, הוא חיוני לחוקרים רבים ויכול לספק מידע משמעותי על תפקוד החלבונים. Co-IF וניתוח מיקרוסקופי לעזור להעריך כמה חלבונים החולקים את אותו חלל תת-תאי. עם זאת, מספר מטרות מוגבל על ידי נוגדנים, אשר חייב להיות הרים בעלי חיים שונים, ועל ידי גישה מיקרוסקופ confocal מצויד לייזרים שונים אורך גלאי ספקטרלי עבור ריבוב. Co-IP מאשרת או מגלה זיקה גבוהה פיזית אינטראקציות betwEen שני חלבונים או יותר המתגוררים בתוך קומפלקס חלבון. למרות הפיתוח של טכניקות חדשניות, כגון העברת אנרגיה תהודה הקרינה (סריג) 12 ו assay קשירת הקרבה (PLA) 13 , אשר יכול לזהות בו זמנית את לוקליזציה ואינטראקציות של חלבונים, שיתוף IP נשאר טכניקה נאותה ובמחיר סביר ללמוד אינטראקציות בין חלבונים אנדוגניים.
שיטת צעד אחר צעד המתוארת בכתב יד זה יקל על המחקר של לוקליזציה חלבון PPIs להצביע על מלכודות להימנע בעת חקר PPIs אנדוגני בבלוטות החלב. המתודולוגיה מתחילה בהצגת הליכי השימור השונים לרקמות הנדרשות לכל טכניקה. חלק 1 מציג כיצד ללמוד חלבון שיתוף לוקליזציה בשלושה שלבים: 1) חתך של בלוטות החלב, ii) פעמיים או משולשת תיוג של חלבונים שונים באמצעות טכניקה שיתוף IF, ו- iii) הדמיה שללוקליזציה של חלבונים. חלק 2 מראה כיצד להאיץ חלבון אנדוגני ולזהות חלבונים אינטראקציה שלה בשלושה שלבים: i) הכנה lysate, ii) immunoprecipitation חלבון עקיף, ו- iii) זיהוי שותף מחייב על ידי SDS-PAGE כתם המערבי. כל צעד של פרוטוקול זה הוא מותאם עבור מכרסמים בלוטות הבלוטות החלב ומייצר באיכות גבוהה, ספציפי, תוצאות לשחזור. פרוטוקול זה יכול לשמש גם כנקודת מוצא ללימודי PPI ברקמות אחרות או שורות תאים.
Protocol
Representative Results
Discussion
תאים תאים אינטראקציות באמצעות צמתים נדרשים לתפקוד תקין ופיתוח של איברים רבים, כגון בלוטת החלב. מחקרים הראו כי חלבונים פונקציונליים יכולים לווסת את הפונקציה ואת היציבות של אחד אחר ולהפעיל transduction האות על ידי קשירה זה לזה בקרום התא 10 . הפרוטוקולים שהוצגו ב?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
IP ממומן על ידי מדעי הטבע והנדסה מועצת המחקר של מענק קנדה (NSERC # 418233-2012); פונדס דה Recherche du Québec-Santé (FRQS), פרס קריירה לסרטן השד של קוובק, ומענק למנהיגים מייסד הקרן הקנדית לחדשנות. א.ד. קיבל מלגה מארגון ארנדנד-פריייר.
Materials
| Mice strain and stage | St. Constant, Quebec, Canada | C57BL/6 Femals; pregnancy day 18 (P18) and lactation day 14 (L14), Charles River Canada | |
| PBS 10X (stock) | 1) Dissolve 80g NaCl (F.W.: 58.44), 2g KCl (F.W. 74.55), 26.8g Na2HPO4•7H2O (F.W. 268.07) and 2.4g KH2PO4 (F.W.:136.09) in 800ml distilled water. 2) Adjust the PH to 7.4 3) Add water to reach to the 1 litre final volume. |
||
| TBS 10X (stock) | 1) Dissolve 60.5g TRIS, 87.6g NaCl in 800ml distilled water. 2) Adjust the PH to 7.5 3) Add water to reach to the 1 litre final volume. |
||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Part 1-Immunofluorescence | |||
| Freezing media | VWR International, Ville Mont-Royal, QC, Canada | 95067-840 | VMR frozen sections compound |
| Microtome | Mississauga, ON, Canada | 956640 | Microm HM525, Thermo fisher scientific HM525 NX Cryostat 115V 60Hz |
| Blades | C.L. Sturkey, Inc. Les Produits Scientifiques ESBE St-Laurent, QC, Canada | BLM1001C | High profile gold coated blades |
| Pap pen | Cedarlane, Burlington, ON, Canada | 8899 | Super PAP Pen, Thermo fisher scientific |
| Microscopic slides | Fisher Scientific, Burlington, ON, Canada | 12-550-15 | Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides |
| Formaldehyde | BioShop Canada Inc, Burlington, ON, Canada | FOR201.1 | Forlmadehyde |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Santa Cruz Biotechnology, Inc, California, USA | ||
| Blocking solution | 3% BSA in TBS | ||
| Wash solution | TBS-Tween 20 0.1% | ||
| Polysorbate 20 | Oakville, ON, Canada | P 9416 | Tween 20, Sigma-Aldrich |
| Mounting media | Cedarlane, Burlington, ON | 17984-25(EM) | Fluoromount-G |
| First & secondary antibodies | Cell Signaling, Beverly, MA, USA | Mentioned in Column D | E-Cadherin (4A2) Mouse mAb (#14472s) 1/50 (Cell Signaling) with anti-mouse IgG Fab2 Alexa Fluor 555 (#4409s), Cell Signaling |
| First & secondary antibodies | Life technologies, Waltham, MA, USA & Cell Signaling, Beverly, MA, USA | Mentioned in Column D | Claudin-7 (#34-9100) 1/100 (Life Technologies) with anti-rabbit IgG Fab2 Alexa Fluor 488 (#4412s) (Cell Signaling) |
| First & secondary antibodies | Santa Cruz Biotechnology, Inc, California, USA; Fischer Scientific, Burlington, ON, Canada | Mentioned in Column D | β-Catenin Antibody (C-18): sc-1496 (SANTA CRUZ) with anti-Goat IgG (H+L) Alexa Fluor 568 (#A11057), Molecular Probe (Fisher Scientific) |
| First & secondary antibodies | Life technologies, Waltham, MA, USA & Cell Signaling, Beverly, MA, USA | Mentioned in Column D | Connexin26 (#33-5800) 1/75 (Life Technologies) with anti-mouse IgG Fab2 Alexa Fluor 647 (#4410s) |
| Nuclei stain | Fisher Scientific, Burlington, ON, Canada | D1306 | DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) 1/1000 in PBS |
| Fluorescent microscope | Nikon Canada, Mississauga, On, Canada | Nikon A1R+ confocal microscopic laser equipped with a spectral detector | |
| Software of IF images analysis | Nikon Canada, Mississauga, On, Canada | NIS-elements software (version 4) | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Part 2-Immunoprecipitation | |||
| Triple-detergent Lysis buffer (100ml) pH=8.0 | 1) Mix 50mM TRIS (F.W. :121.14), 150mM NaCl (F.W. :58.44), 0.02% Sodium Azide, 0.1% SDS, 1% NONIdET P40, 0.5% Sodium Deoxycholate in 80ml distilled H2O. 2) Adjust the PH to 8.0 with HCl 6N (~0.5ml). 3) Adjust the volume to 100ml. Keep it in fridge. At the day of protein extraction, use 1/100 NaVo3, 1/100 protease/phosphatase inhibitor and 1/25 NAF in calculated amount of Triple detergent lysis buffer: Sodium Fluorid (stock) solution 1.25M (F.W. 41.98), Sodium Orthovanadate (stock) Solution 1M (F.W.: 183.9) |
||
| Protease/phosphatase inhibitor | Fisher Scientific, Burlington, ON | 78441 | Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail, EDTA-free (100X) |
| Protein dosage | Thermo Scientific, Rockford, Illinois, USA | 23225 | Pierce BCA protein assay kit |
| Tissue grinder | Fisher Scientific, Burlington, ON | FTH-115 | Power 125, Model FTH-115 |
| Magnetic beads and stand | Millipore, Etobicoke, ON, Canada | PureProteome Protein G Magnetic Bead System (LSKMAGG02) | |
| Wash solution for IP | PBS or PBS-Tween20 0.1% depending to the step | ||
| Primary antibodies for immunoprecipitation | Cell Signaling, Beverly, MA, USA | Mentioned in coulmn D | IgG Rabbit (rabbit (DA1E) mAb IgG Isotype control (#3900s) (Cell Signaling) 0.5 µl/200 µl |
| Primary antibodies for immunoprecipitation | Cell Signaling, Beverly, MA, USA | Mentioned in coulmn D | IgG Mouse mouse (G3A1) mAb IgG Isotype control (#5415s) (Cell Signaling) 0.5 µl/200 µl |
| Primary antibodies for immunoprecipitation | Sigma-Aldrich, Oakville, ON, Canada | Mentioned in coulmn D | Connexin43 (#C6219) (Sigma-Aldrich) 4 µl/200 µl |
| Primary antibodies for immunoprecipitation | Cell Signaling, Beverly, MA, USA | Mentioned in coulmn D | E-cadherin (4A2) Mouse mAb (#14472s) (Cell Signaling) 1 µl/200 µl |
| Laemmli buffer | BIO-RAD, Mississauga, Ontario, Canada | 1610747 | 4x Laemmli Sample Buffer (Add β-mercaptoethanol following manufacturer recommendation) |
| Acidic glycine | Fisher Scientific, Burlington, ON | PB381-5 | 0.2 M glycine; adjust pH=2.5 with HCl |
| Tris | Fisher Scientific, Burlington, ON | BP152-1 | 1 M (pH=8) |
| SDS-PAGE acrylamide gels | BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada | 1610180 -5 | TGX Stain-Free FastCast Acrylamide Solutionss (7.8%, 10%, 12%) |
| Running buffer 10x | BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada | 1704272 | Tris 30.3g/glycine 144.1g /SDS 10g in 1 litre distilled water |
| Membranes | BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada | 1704272 | PVDF membranes, Trans-Blot Turbo RTA Mini PVDF Transfer Kit |
| Transfer method | BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada | 1704155 | Trans-Blot Turbo Transfer System |
| Dry Milk | Smucker Food of Canada Co, Markham, ON, Canada | Fat Free Instant Skim Milk Powder, Carnation | |
| Blocking solution for blots | 5% dry milk in TBS-Tween 20 0.1% | ||
| Washing solutions for blots | TBS-Tween 20 0.1% | ||
| Primary and secondary antibodies for blots (10ml) | Sigma-Aldrich, Oakville, Ontario & Abcam, Toronto, ON, Canada | Mentioned in column D | Connexin43 (#C6219) (Sigma-Aldrich) 1/2500 with HRP-conjugated Veriblot for IP secondary antibody (ab131366) 1/5000 (Abcam, Toronto, ON, Canada) |
| Primary and secondary antibodies for blots (10ml) | Cell Signaling, Beverly, MA, USA & Abcam, Toronto, ON, Canada | Mentioned in column D | E-cadherin (24E10) rabbit mAb 1/1000 (#3195s) (Cell Signaling) 1/1000 with HRP-conjugated Veriblot for IP secondary antibody (ab131366) 1/5000 (Abcam, Toronto, ON, Canada) |
| Primary and secondary antibodies for blots (10ml) | Life technologies, Waltham, MA, USA & Abcam, Toronto, ON, Canada | Mentioned in column D | Claudin-7 (#34-9100) (Life technologies) 1/1000 with HRP-conjugated Veriblot for IP secondary antibody (ab131366) 1/5000 (Abcam, Toronto, ON, Canada) |
| Primary and secondary antibodies for blots (10ml) | Life technologies, Waltham, MA, USA & Abcam, Toronto, ON, Canada | Mentioned in column D | Claudin3 (#34-1700) (Life technologies) 1/1000 with HRP-conjugated Veriblot for IP secondary antibody (ab131366) 1/5000 (Abcam, Toronto, ON, Canada) |
| Luminol solution for signal detection on blots | BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada | 1705061 | Clarity Western ECL Blotting Substrate |
| Imaging blots | BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada | 1708280 | ChemiDoc MP imaging system |
| Analayzing blots | BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada | ImageLab 5.2 software | |
References
- Sternlicht, M. D. Key stages in mammary gland development: the cues that regulate ductal branching morphogenesis. Breast Cancer Res. 8 (1), 201 (2006).
- Oakes, S. R., Hilton, H. N., Ormandy, C. J. The alveolar switch: coordinating the proliferative cues and cell fate decisions that drive the formation of lobuloalveoli from ductal epithelium. Breast Cancer Res. 8 (2), 207 (2006).
- Stein, T., Hilton, H. N., Ormandy, C. J. The alveolar switch: coordinating the proliferative cues and cell fate decisions that drive the formation of lobuloalveoli from ductal epithelium. Breast Cancer Res. 8 (2), 207 (2006).
- El-Sabban, M. E., Abi-Mosleh, L. F., Talhouk, R. S. Developmental regulation of gap junctions and their role in mammary epithelial cell differentiation. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 8 (4), 463-473 (2003).
- Hennighausen, L., Robinson, G. W. Information networks in the mammary gland. Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (9), 715-725 (2005).
- Gudjonsson, T., Adriance, M. C., Sternlicht, M. D., Petersen, O. W., Bissell, M. J. Myoepithelial cells: their origin and function in breast morphogenesis and neoplasia. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 10 (3), 261-272 (2005).
- Nguyen, D. A., Neville, M. C. Tight junction regulation in the mammary gland. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 3 (3), 233-246 (1998).
- Stewart, M. K., Simek, J., Laird, D. W. Insights into the role of connexins in mammary gland morphogenesis and function. Reproduction. 149 (6), R279-R290 (2015).
- Dianati, E., Poiraud, J., Weber-Ouellette, A., Connexins Plante, I., E-cadherin, Claudin-7 and beta-catenin transiently form junctional nexuses during the post-natal mammary gland development. Dev Biol. 416 (1), 52-68 (2016).
- Derangeon, M., Spray, D. C., Bourmeyster, N., Sarrouilhe, D., Herve, J. C. Reciprocal influence of connexins and apical junction proteins on their expressions and functions. Biochim Biophys Acta. 1788 (4), 768-778 (2009).
- Hernandez-Blazquez, F. J., Joazeiro, P. P., Omori, Y., Yamasaki, H. Control of intracellular movement of connexins by E-cadherin in murine skin papilloma cells. Exp Cell Res. 270 (2), 235-247 (2001).
- Kiyokawa, E., Hara, S., Nakamura, T., Matsuda, M. Fluorescence (Forster) resonance energy transfer imaging of oncogene activity in living cells. Cancer Sci. 97 (1), 8-15 (2006).
- Gustafsdottir, S. M., et al. Proximity ligation assays for sensitive and specific protein analyses. Anal Biochem. 345 (1), 2-9 (2005).
- Plante, I., Stewart, M. K., Laird, D. W. Evaluation of mammary gland development and function in mouse models. J Vis Exp. (53), (2011).
- Green, M. R., Sambrook, J., Sambrook, J. . Molecular cloning: a laboratory manual. , (2012).
- Taylor, S. C., Berkelman, T., Yadav, G., Hammond, M. A defined methodology for reliable quantification of Western blot data. Mol Biotechnol. 55 (3), 217-226 (2013).
- Oxford, E. M., et al. Molecular composition of the intercalated disc in a spontaneous canine animal model of arrhythmogenic right ventricular dysplasia/cardiomyopathy. Heart Rhythm. 4 (9), 1196-1205 (2007).
- Wang, X., Li, S. Protein mislocalization: mechanisms, functions and clinical applications in cancer. Biochim Biophys Acta. 1846 (1), 13-25 (2014).
- Bertocchi, C., et al. Nanoscale architecture of cadherin-based cell adhesions. Nat Cell Biol. 19 (1), 28-37 (2017).
- Bajar, B. T., Wang, E. S., Zhang, S., Lin, M. Z., Chu, J. A Guide to Fluorescent Protein FRET Pairs. Sensors (Basel). 16 (9), (2016).
- Fredriksson, K., et al. Proteomic analysis of proteins surrounding occludin and claudin-4 reveals their proximity to signaling and trafficking networks. PLoS One. 10 (3), e0117074 (2015).
- Weibrecht, I., et al. Proximity ligation assays: a recent addition to the proteomics toolbox. Expert Rev Proteomics. 7 (3), 401-409 (2010).
- Malovannaya, A., et al. Streamlined analysis schema for high-throughput identification of endogenous protein complexes. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (6), 2431-2436 (2010).
