Analisi delle interazioni proteine-proteine e co-localizzazione tra i componenti di giunzione, stretti e giunti aderenti in ghiandole mammarie murine
Summary
Le giunzioni intercellulari sono requisiti per le funzioni specifiche e lo sviluppo delle ghiandole mammarie. Questo manuale fornisce un protocollo dettagliato per lo studio delle interazioni proteico-proteiche (PPIs) e la co-localizzazione usando le ghiandole mammarie murine. Queste tecniche consentono l'analisi della dinamica dell'associazione fisica tra giunzioni intercellulari a differenti fasi di sviluppo.
Abstract
Le interazioni delle cellule cellulari svolgono un ruolo fondamentale nel preservare l'integrità dei tessuti e la barriera tra i diversi compartimenti della ghiandola mammaria. Queste interazioni sono fornite da proteine junctional che formano nexus tra cellule adiacenti. La misloalizzazione della proteina giunzionale e la riduzione delle associazioni fisiche con i loro partner di legame possono provocare la perdita di funzione e, di conseguenza, la disfunzione dell'organismo. Quindi, identificare la localizzazione proteica e le interazioni proteine-proteine (PPI) nei tessuti normali e legati alla malattia è essenziale per trovare nuove evidenze e meccanismi che conducano alla progressione di malattie o alterazioni nello stato di sviluppo. Questo manuale presenta un metodo in due fasi per valutare i PPI in ghiandole mammarie murine. Nella sezione 1 del protocollo, è descritto un metodo per eseguire co-immunofluorescenza (co-IF) usando anticorpi sollevati contro le proteine di interesse, seguite da anticorpi secondari etichettati con fluorochromi. Anche se co-IF tuttiPer la dimostrazione della vicinanza delle proteine, rende possibile studiare le loro interazioni fisiche. Di conseguenza, un protocollo dettagliato per la co-immunoprecipitazione (co-IP) è fornito nella sezione del protocollo 2. Questo metodo è utilizzato per determinare le interazioni fisiche tra le proteine, senza confermare se queste interazioni sono dirette o indirette. Negli ultimi anni, le tecniche co-IF e co-IP hanno dimostrato che alcuni componenti delle giunzioni intercellulari co-localizzano e interagiscono insieme, creando nexus giunzionali dipendenti da fase che variano durante lo sviluppo della ghiandola mammaria.
Introduction
La crescita e lo sviluppo delle ghiandole mammarie si verificano principalmente dopo la nascita. Questo organo si rinnova costantemente per tutta la vita riproduttiva di un mammifero1. L'epitelio adulte della ghiandola mammaria è composto da uno strato interno di cellule epiteliali luminali e da uno strato esterno di cellule basali, composto principalmente da cellule mioepiteleali, circondate da una membrana basale 2 . Per una buona revisione della struttura e dello sviluppo delle ghiandole mammarie, il lettore può fare riferimento a Sternlicht 1 . Le interazioni delle cellule cellulari attraverso il divario (GJ), i giunti stretti (TJ) e gli aderenti (AJ) sono necessari per lo sviluppo normale e la funzione della ghiandola 1 , 3 , 4 , 5 , 6 . Le principali componenti di queste giunzioni nella ghiandola mammaria murina sono Cx26, Cx30, Cx32 e Cx43 (GJ); Claudin-1, -3, -4 e -7 eZO-1 (TJ); E E-cadherina, P-cadherina e β-catenina (AJ) 7 , 8 . I livelli di espressione di queste diverse proteine junzionali variano in modo dipendente dalla fase durante lo sviluppo della ghiandola mammaria, suggerendo requisiti di interazione cellulare-cellule differenziali 9 . GJ, TJ e AJ sono collegati strutturalmente e funzionalmente e collegano altre proteine strutturali o regolamentari ai siti vicini di cellule adiacenti, creando così un collegamento giunzionale 10 . La composizione del nesso giunzionale può influenzare il ponte con il citoscheletro sottostante, nonché la permeabilità e la stabilità del nesso e può quindi influenzare la funzione della ghiandola 8 , 9 , 10 , 11 . I componenti delle giunzioni intercellulari che risiedono in nexus giunzionali o interagiscono tra di loro a diffLe fasi di sviluppo progressive dello sviluppo delle ghiandole mammarie sono state recentemente analizzate utilizzando co-immunofluorescenza (co-IF) e co-immunoprecipitazione (co-IP) 9 . Mentre altre tecniche consentono la valutazione dell'associazione funzionale tra proteine, questi metodi non sono presentati in questo manoscritto.
Poiché le proteine agiscono solo per funzionare, studiare le interazioni proteine-proteine (PPI), quali trasduzione di segnali e cascate biochimiche, è essenziale per molti ricercatori e può fornire informazioni significative sulla funzione delle proteine. Co-IF e analisi microscopica aiutano a valutare alcune proteine che condividono lo stesso spazio subcellulare. Tuttavia, il numero degli obiettivi è limitato dagli anticorpi che devono essere elevati in diversi animali e dall'accesso a un microscopio confocale dotato di diversi laser a lunghezza d'onda e di un rivelatore spettrale per il multiplexing. Co-IP conferma o rivela interazioni fisiche di elevata affinità tra i dueDue o più proteine che risiedono all'interno di un complesso proteico. Nonostante lo sviluppo di nuove tecniche, come il trasferimento di energia di risonanza di fluorescenza (FRET) 12 e il test di legatura di prossimità (PLA) 13 , che possono contemporaneamente rilevare la localizzazione e le interazioni delle proteine, il co-IP rimane una tecnica appropriata e conveniente per studiare le interazioni tra Proteine endogene.
Il metodo passo-passo descritto in questo manoscritto agevolerà lo studio della localizzazione proteica e dei PPI e segna le insidie per evitare quando studia PPI endogeni nelle ghiandole mammarie. La metodologia inizia con la presentazione delle diverse procedure di conservazione dei tessuti necessari per ogni tecnica. La Parte 1 illustra come studiare la co-localizzazione proteica in tre fasi: i) la sezione delle ghiandole mammarie, ii) la doppia o tripla etichettatura di diverse proteine usando la tecnica co-IF, e iii) l'imaging diLocalizzazione proteica. La seconda parte mostra come precipitare una proteina endogena e identificare le sue proteine interagenti in tre fasi: i) preparazione di lysate, ii) immunoprecipitazione indiretta di proteine e iii) identificazione del partner di legame mediante SDS-PAGE e Western blot. Ogni fase di questo protocollo è ottimizzata per i tessuti delle ghiandole mammarie di roditore e genera risultati di alta qualità, specifici e riproducibili. Questo protocollo può anche essere utilizzato come punto di partenza per gli studi PPI in altri tessuti o linee cellulari.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le interazioni cellulare attraverso le giunzioni sono necessarie per la corretta funzione e lo sviluppo di molti organi, come la ghiandola mammaria. Gli studi hanno dimostrato che le proteine giunzionali possono regolare la funzione e la stabilità dell'altro e attivare la trasduzione del segnale legandosi tra loro alla membrana cellulare 10 . I protocolli presentati nel manoscritto attuale hanno fornito interessanti risultati sull'espressione, la localizzazione e l'interazione …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
IP è finanziato da una sovvenzione scientifica di scienze naturali e ingegneria del Canada (NSERC # 418233-2012); Un Fonds de Recherche du Québec-Santé (FRQS), un premio per la carriera di Cancer Breast Cancer di Quebec, e una sovvenzione di Leader Found della sovvenzione Canadian Foundation for Innovation. ED ha ricevuto una borsa di studio dalla Fondation universitaire Armand-Frappier.
Materials
| Mice strain and stage | St. Constant, Quebec, Canada | C57BL/6 Femals; pregnancy day 18 (P18) and lactation day 14 (L14), Charles River Canada | |
| PBS 10X (stock) | 1) Dissolve 80g NaCl (F.W.: 58.44), 2g KCl (F.W. 74.55), 26.8g Na2HPO4•7H2O (F.W. 268.07) and 2.4g KH2PO4 (F.W.:136.09) in 800ml distilled water. 2) Adjust the PH to 7.4 3) Add water to reach to the 1 litre final volume. |
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| TBS 10X (stock) | 1) Dissolve 60.5g TRIS, 87.6g NaCl in 800ml distilled water. 2) Adjust the PH to 7.5 3) Add water to reach to the 1 litre final volume. |
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| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Part 1-Immunofluorescence | |||
| Freezing media | VWR International, Ville Mont-Royal, QC, Canada | 95067-840 | VMR frozen sections compound |
| Microtome | Mississauga, ON, Canada | 956640 | Microm HM525, Thermo fisher scientific HM525 NX Cryostat 115V 60Hz |
| Blades | C.L. Sturkey, Inc. Les Produits Scientifiques ESBE St-Laurent, QC, Canada | BLM1001C | High profile gold coated blades |
| Pap pen | Cedarlane, Burlington, ON, Canada | 8899 | Super PAP Pen, Thermo fisher scientific |
| Microscopic slides | Fisher Scientific, Burlington, ON, Canada | 12-550-15 | Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides |
| Formaldehyde | BioShop Canada Inc, Burlington, ON, Canada | FOR201.1 | Forlmadehyde |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Santa Cruz Biotechnology, Inc, California, USA | ||
| Blocking solution | 3% BSA in TBS | ||
| Wash solution | TBS-Tween 20 0.1% | ||
| Polysorbate 20 | Oakville, ON, Canada | P 9416 | Tween 20, Sigma-Aldrich |
| Mounting media | Cedarlane, Burlington, ON | 17984-25(EM) | Fluoromount-G |
| First & secondary antibodies | Cell Signaling, Beverly, MA, USA | Mentioned in Column D | E-Cadherin (4A2) Mouse mAb (#14472s) 1/50 (Cell Signaling) with anti-mouse IgG Fab2 Alexa Fluor 555 (#4409s), Cell Signaling |
| First & secondary antibodies | Life technologies, Waltham, MA, USA & Cell Signaling, Beverly, MA, USA | Mentioned in Column D | Claudin-7 (#34-9100) 1/100 (Life Technologies) with anti-rabbit IgG Fab2 Alexa Fluor 488 (#4412s) (Cell Signaling) |
| First & secondary antibodies | Santa Cruz Biotechnology, Inc, California, USA; Fischer Scientific, Burlington, ON, Canada | Mentioned in Column D | β-Catenin Antibody (C-18): sc-1496 (SANTA CRUZ) with anti-Goat IgG (H+L) Alexa Fluor 568 (#A11057), Molecular Probe (Fisher Scientific) |
| First & secondary antibodies | Life technologies, Waltham, MA, USA & Cell Signaling, Beverly, MA, USA | Mentioned in Column D | Connexin26 (#33-5800) 1/75 (Life Technologies) with anti-mouse IgG Fab2 Alexa Fluor 647 (#4410s) |
| Nuclei stain | Fisher Scientific, Burlington, ON, Canada | D1306 | DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) 1/1000 in PBS |
| Fluorescent microscope | Nikon Canada, Mississauga, On, Canada | Nikon A1R+ confocal microscopic laser equipped with a spectral detector | |
| Software of IF images analysis | Nikon Canada, Mississauga, On, Canada | NIS-elements software (version 4) | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Part 2-Immunoprecipitation | |||
| Triple-detergent Lysis buffer (100ml) pH=8.0 | 1) Mix 50mM TRIS (F.W. :121.14), 150mM NaCl (F.W. :58.44), 0.02% Sodium Azide, 0.1% SDS, 1% NONIdET P40, 0.5% Sodium Deoxycholate in 80ml distilled H2O. 2) Adjust the PH to 8.0 with HCl 6N (~0.5ml). 3) Adjust the volume to 100ml. Keep it in fridge. At the day of protein extraction, use 1/100 NaVo3, 1/100 protease/phosphatase inhibitor and 1/25 NAF in calculated amount of Triple detergent lysis buffer: Sodium Fluorid (stock) solution 1.25M (F.W. 41.98), Sodium Orthovanadate (stock) Solution 1M (F.W.: 183.9) |
||
| Protease/phosphatase inhibitor | Fisher Scientific, Burlington, ON | 78441 | Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail, EDTA-free (100X) |
| Protein dosage | Thermo Scientific, Rockford, Illinois, USA | 23225 | Pierce BCA protein assay kit |
| Tissue grinder | Fisher Scientific, Burlington, ON | FTH-115 | Power 125, Model FTH-115 |
| Magnetic beads and stand | Millipore, Etobicoke, ON, Canada | PureProteome Protein G Magnetic Bead System (LSKMAGG02) | |
| Wash solution for IP | PBS or PBS-Tween20 0.1% depending to the step | ||
| Primary antibodies for immunoprecipitation | Cell Signaling, Beverly, MA, USA | Mentioned in coulmn D | IgG Rabbit (rabbit (DA1E) mAb IgG Isotype control (#3900s) (Cell Signaling) 0.5 µl/200 µl |
| Primary antibodies for immunoprecipitation | Cell Signaling, Beverly, MA, USA | Mentioned in coulmn D | IgG Mouse mouse (G3A1) mAb IgG Isotype control (#5415s) (Cell Signaling) 0.5 µl/200 µl |
| Primary antibodies for immunoprecipitation | Sigma-Aldrich, Oakville, ON, Canada | Mentioned in coulmn D | Connexin43 (#C6219) (Sigma-Aldrich) 4 µl/200 µl |
| Primary antibodies for immunoprecipitation | Cell Signaling, Beverly, MA, USA | Mentioned in coulmn D | E-cadherin (4A2) Mouse mAb (#14472s) (Cell Signaling) 1 µl/200 µl |
| Laemmli buffer | BIO-RAD, Mississauga, Ontario, Canada | 1610747 | 4x Laemmli Sample Buffer (Add β-mercaptoethanol following manufacturer recommendation) |
| Acidic glycine | Fisher Scientific, Burlington, ON | PB381-5 | 0.2 M glycine; adjust pH=2.5 with HCl |
| Tris | Fisher Scientific, Burlington, ON | BP152-1 | 1 M (pH=8) |
| SDS-PAGE acrylamide gels | BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada | 1610180 -5 | TGX Stain-Free FastCast Acrylamide Solutionss (7.8%, 10%, 12%) |
| Running buffer 10x | BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada | 1704272 | Tris 30.3g/glycine 144.1g /SDS 10g in 1 litre distilled water |
| Membranes | BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada | 1704272 | PVDF membranes, Trans-Blot Turbo RTA Mini PVDF Transfer Kit |
| Transfer method | BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada | 1704155 | Trans-Blot Turbo Transfer System |
| Dry Milk | Smucker Food of Canada Co, Markham, ON, Canada | Fat Free Instant Skim Milk Powder, Carnation | |
| Blocking solution for blots | 5% dry milk in TBS-Tween 20 0.1% | ||
| Washing solutions for blots | TBS-Tween 20 0.1% | ||
| Primary and secondary antibodies for blots (10ml) | Sigma-Aldrich, Oakville, Ontario & Abcam, Toronto, ON, Canada | Mentioned in column D | Connexin43 (#C6219) (Sigma-Aldrich) 1/2500 with HRP-conjugated Veriblot for IP secondary antibody (ab131366) 1/5000 (Abcam, Toronto, ON, Canada) |
| Primary and secondary antibodies for blots (10ml) | Cell Signaling, Beverly, MA, USA & Abcam, Toronto, ON, Canada | Mentioned in column D | E-cadherin (24E10) rabbit mAb 1/1000 (#3195s) (Cell Signaling) 1/1000 with HRP-conjugated Veriblot for IP secondary antibody (ab131366) 1/5000 (Abcam, Toronto, ON, Canada) |
| Primary and secondary antibodies for blots (10ml) | Life technologies, Waltham, MA, USA & Abcam, Toronto, ON, Canada | Mentioned in column D | Claudin-7 (#34-9100) (Life technologies) 1/1000 with HRP-conjugated Veriblot for IP secondary antibody (ab131366) 1/5000 (Abcam, Toronto, ON, Canada) |
| Primary and secondary antibodies for blots (10ml) | Life technologies, Waltham, MA, USA & Abcam, Toronto, ON, Canada | Mentioned in column D | Claudin3 (#34-1700) (Life technologies) 1/1000 with HRP-conjugated Veriblot for IP secondary antibody (ab131366) 1/5000 (Abcam, Toronto, ON, Canada) |
| Luminol solution for signal detection on blots | BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada | 1705061 | Clarity Western ECL Blotting Substrate |
| Imaging blots | BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada | 1708280 | ChemiDoc MP imaging system |
| Analayzing blots | BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada | ImageLab 5.2 software | |
References
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