Burada, yüksek örnekleme frekansı verir ve bir laparotomi performans ile karşılaştırıldığında, cerrahi komplikasyonlar potansiyelini azaltır makaklarda karaciğer ve mezenterik lenf düğümlerinden (MLN) seri örnekleme için minimal invaziv bir laparoskopik tekniği açıklar.
mezenterik lenf düğümlerinden (MLN) ve karaciğer bunları immünolojik benzersiz yapım, mide-barsak (GI) sistemin mikroplar ve mikrobiyal ürünler maruz kalmaktadır. Gastrointestinal sistem ve ilişkili MLN, insan bağışıklık eksikliği virüsü (HIV) enfeksiyonu ile erken viral replikasyonun siteleri ve MLN daha uzun süreli anti-retroviral tedavi (ART) sonra kuluçkada enfekte olmuş hücreleri barındıran muhtemelen önemli rezervuar yerleridir. Karaciğer Lentivirüslerden immün yanıtlarda önemli bir rol oynadığı gösterilmiştir ve dolaşımdan virüsün temizlenmesinde önemli bir rol oynuyor gibi görünmektedir edilmiştir. İnsan-olmayan primat, HIV ve Kazanılan Bağışıklık Eksikliği Sendromu (AİDS) için (NSP) modelleri yakından enfeksiyon kritik olaylar aydınlatmak için yardımcı olur, HIV enfeksiyonu ve viral replikasyon ve bu modelde olarak ilişkili immün cevapların primer siteye seri boyuna örnekleme bu özelliklerini taklit eden, patogenez ve bu olaylar üzerinde çeşitli müdahale stratejilerinin etkisi. Current yayınlanan teknikler karaciğer örnek ve MLN birlikte aynı hayvanda bir seri biçimde bu önemli yerlerin araştırılması için sınırlar büyük cerrahi ve / veya otopsi, içerir. Daha önce MLN toplanması için bir laparoskopik tekniği tarif var. Burada, MLN toplanması için gerekli olan aynı iki bağlantı noktası yerleri ile karaciğer ve MLN'sinin seri boyuna örnekleme için minimal invaziv bir laparoskopik tekniği açıklar. ilave kesikler gerekli olduğu gibi aynı iki bağlantı noktası kullanımı hayvanlara etkisini en aza indirir. Bu teknik, büyük karın cerrahisi ile karşılaştırıldığında artmış bir örnekleme frekansı ile kullanılan ve cerrahi komplikasyon riskini ve sonuçların yorumlanmasını karmaşık hale getirebilir lokal ve sistemik inflamatuar yanıt ilişkilendirilebilir. Bu prosedür hayvan refahı geliştirirken NHP modellerini kapsayan çalışmalar kolaylaştırmak için potansiyele sahiptir.
Mide-bağırsak (GI), vücudun en büyük mukoza yüzeyi olan ve yaygın olarak mikrobiyomu 1, 2 olarak adlandırılan, gıda, patojenler ve endosimbiyotik bakteri topluluklarının türetilen bir antijen sayısız maruz kalmaktadır. Mezenterik lenf düğümlerinden (MLN) gastrointestinal sistem hat ve bu farklı antijenlere karşı enflamatuar veya tolerojenik yanıtları teşvik etmek için immün fonksiyonun bir asıl yer bulunmaktadır. MLN'sinin fiziksel organizasyon lokal sistemik tepkiler 3 meydana getirmeden antijenlere yanıt verebilir bölmelere ayrılmış bir sistem oluşturur. Benzer şekilde, dolaşım dönen ve böylece lamina propria içine GI yolundan konuma transfer ve kan dolaşımına 4 girmiş mikropların ve mikrobiyal ürünlere maruz önce portal ven yoluyla karaciğere GI yolu düşene kan. Karaciğer aynı zamanda ikinci bir lenfoid organ a olarak işlevnd Transloke Mikroplar 5, 6 kaldırmak için özel makrofajlar gibi immün hücrelerin çok sayıda vardır. Bu nedenle, MLN ve karaciğer Gl kommensal ve patojenik bakterilere maruz primer immün organlar, hem de başka kaynaklardan gelen antijenleri ortam, olan bir imünolojik açıdan onları benzersiz ve önemli adrestir.
MLN Human Immunodeficiency Virus (HIV) veya patojenik maymun bağışıklık yetmezliği virüsü (SIV) enfeksiyon virolojik ve immünolojik etkilerinin değerlendirilmesi için kritik siteler ve muhtemelen intrarektal tehdit sonrasında SIV erken yayılması ilgilidirler. Bağırsak ile ilişkili lenfoid doku Modern antiretroviral tedaviler (ART) 7 ile viremi etkin kontrolü rağmen, kalıcı HIV replikasyonunun önemli bir yer olarak bilinir. SIV enfeksiyonu modellerinde, MLN latent virüsün önemli rezervuarları olduğu gösterilmiştir ve mayıs edilmiştirana hazne 8, 9 olabilir. Akut SIV enfeksiyonu 10 boyunca makak karaciğerlerinde SIV spesifik CD8 + T hücrelerinin birikimi ile kanıtlandığı gibi karaciğer de lentiviral enfeksiyon önemlidir. Ayrıca, bu dolaşım 11 virüs temizleme için sorumlu başlıca organdır.
HIV ve SIV enfeksiyonu değiştirilmiş Gl mikrobiyota ile ilişkilidir, Gl epitel entegriteyi bozulur ve çevresi ve dolaşım 12, 13 içine kolon mikroplar ve mikrobiyal ürünler translokasyonunu artmıştır. Bu işlemler, lokal ve sistemik immün aktivasyonu ile bağlantılı ve HIV ile enfekte olmuş bireylerin 14 morbidite ve mortalite riski vardır. SIV enfeksiyonunda transloke bakteri mikrofon birikimi ise, MLN 15 gözlenmiştirkaraciğerde robial ürünleri organı 16 enflamasyon ve zarar görmesine neden olduğu gösterilmiştir. Bu nedenle, HIV ve SIV enfeksiyonlarına bağlamında, MLN ve karaciğer Gl yerleşik bakteri tarafından tahrik ettiği enflamatuar süreçleri anlamak için oldukça bilgi verici olabilir.
Burada, insan-olmayan primatlarda (NHPs) seri MLN'sinin örnekleme ve karaciğer için minimal invaziv bir laparoskopik teknik sunar. Her cerrahi arasında her hayvana 160 gün ile iki kez, örnekleme, iki sağlıklı dışı makaklar (RMler) bu tekniğin başarılı bir performans sergiledik. Bu iki zaman aralığında yüksek tutarlı veri değerlendirme ve akış sitometrisi kullanılarak, her bir organ içinde önemli lökosit ve lenfosit karşılaştırılabilmesi ve göstermek için bu örneklerin kullanımı gidin.
Burada, bu çalışmada açıklanmayan bu ve diğer hayvanlarda% 100 başarı oranı vardı seri MLN'sinin toplama ve karaciğer biyopsileri için minimal invaziv tekniği göstermektedir. Ayrıca, zaman içinde aynı hayvanlar üzerinde bu tekniğin kullanılması herhangi bir olumsuz olaylarla ilişkili edilmemiştir. Gerçekten de, SIV, maymun / insan bağışıklık eksikliği virüsü (SHIV) kullanmaktadır, veya Zika virüsü (yayınlanmamış veriler) ile aşılanmış hayvanların diğer gruplar halinde bu tekniğin kullanımından kaynaklanan komplikasyon olmuştur. Benzer şekilde, bu ameliyat bile daha önce, majör abdominal cerrahi geçiren hayvanlarda ve trombositopenik hayvanların (yayınlanmamış veriler) başarılı olduğu kanıtlanmıştır. Biz ek kesiler ihtiyacını kaçınarak karaciğere MLN geçildiğinde bu numuneler kamera konumunu tersine çevirerek aynı iki limanları aracılığıyla toplanan edilebileceğini gösterdi. MLN toplanmasını etkileyen faktörler daha önce 13 bildirilmiştir.
<p3 MLN ve 3 karaciğer biyopsileri her dört koleksiyonlarına kadar class = "jove_content"> komplikasyon olmadan bireysel hayvanlar üzerinde zaman içinde gerçekleştirilmiş, verilere başarı oranlarındaki değişiklikler veya değişiklik topladı. Buna ek olarak, bu laparoskopik MLN / karaciğer toplama tekniği başarılı bir şekilde geniş değerlendirilmesini sağlayan aynı anestezi etkinlikte periferal LN, endoskopik üst ve alt GI biyopsiler, kemik iliği, beyin-omurilik sıvısı toplama toplanması ve damar delme gibi diğer işlemler ile kombine edilmiş virolojik ve seri bir şekilde immünolojik tepkiler (yayınlanmamış veriler).tamamlamak için 45 dakika karıştırılır ve iki ~ 0.5 cm kesiklerden elde edilir – İşlemin tamamı tipik olarak 30 alır. şişman hayvan olarak, daha büyük bir kesi yapmak için gerekli olabilir – ile MLG almak için (~ 1 ila 1.5 cm) yapılır ve tamamlanması için ek süre gerektirebilir. Kapsamlı mezenterik yağ ile hayvanlar genellikle d önemli bir deneyime ihtiyaççevredeki yağdan MLG ifferentiate. MLN sıklıkla mezenterik damarların boyunca bulundu ve damarlarda şube yerlerin yakınında daha yaygın olduğu görülüyor edilmektedir. Bu tekniğin bir kritik bir yönü mezenter abdominal kesikten batın için yeterli hareketli olması seçilen MLG gerektirmesidir. Sonuç olarak, bu teknik mezenter köküne MLN yakın toplamak için kullanılamaz. Nedeniyle büyütmeye, bu kamera ile MLG tespit etmek ve MLN yakın kavrama yerinin ve dışarıya alınır kez düğümün belirlenmesi ile yardımcı olabilir kolay kez atar.
Trendelenburg pozisyonunda kullanılması her zaman MLN toplanması için gerekli olmayabilir ve MLN kolayca Trendelenburg pozisyonuna kullanılmadan alınabilir eğer o kraniyale kaymasını organlarını önleyecektir olarak karaciğer biyopsileri kolay hale getirebilir. Zaman zaman, Trendelenburg pozisyonuna yerleştirildikten sonra, karaciğer diyafram ve şırası karşı kaydırılır nazikçe geri biyopsi koleksiyonuna önce pozisyona manipüle edilebilir. MLN toplama noktası yerleştirme sola olduğu gibi onlar kanül daha yakın olarak, karaciğer biyopsileri genellikle sol yanal ve sol medial karaciğer lobu alınır.
MLN Toplanan ve karaciğer biyopsileri alt analizler, çeşitli için yeterli hücre verimi sağlanır ve toplanan hücrelerin yüksek yaşayabilirliği göstermemiştir. Burada hücreler lökosit ve lenfosit popülasyonu akış sitometrik analiz için boyanmıştır ve bu iki önemli bağışıklık organları arasında önemli farklılıklar ortaya konamamıştır. Örneğin, MLN yüksek iltihaplı yönetmek için, hem de CD4 + T önemine toplama ve adaptif bağışıklık tepkilerini yayılması için merkez noktaları olarak MLN'sinin önemi nedeniyle, karaciğere kıyasla, CD4 + T hücreleri için zenginleştirilmiş ve ortama tolerojenik tepkileri diyet alımı ve Gl yerleşik mikroorganizmalardan türetilen antijenleris = "xref"> 24. Ancak, karaciğer önemli MLN'sinin karşılaştırıldığında CD14 + lökositler için zenginleştirilmiştir. CD14 monosit ve makrofajlar üzerinde ağırlıklı olarak ifade edilir ve bakteriyel lipopolisakarit (LPS) 25 reseptör kompleksi önemli bir bileşenidir. Gerçekten de, çözünür CD14 yüksek plazma konsantrasyonları mikrobiyal translokasyon ve HIV bağışıklık aktivasyonu ve patojenik SIV enfeksiyonu 26 ile ilişkilidir. MLN karşılaştırıldığında Böylece, karaciğer CD14 + lökositlerin yüksek frekansları muhtemel bu organda daha büyük bir bakteri yükünün sonucudur.
Burada, seri MLN'sinin toplanması ve herhangi bir olumsuz sonuçlara yol açmamıştır laparoskopik giriş için sadece iki küçük kesi kullanılarak karaciğer biyopsileri için hızlı ve minimal invaziv cerrahi tekniği göstermektedir. Bu örnekler pla almak önemli immünolojik, virolojik ve mikrobiyolojik süreçlerini değerlendirmek için yararlı bir yol sağlayabilirSistemik bağışıklık ayrı ve farklı olan MLN ve karaciğerde ce. Benzer şekilde, karaciğer biyopsisi çoğunlukla önemli karaciğer hasarı 16 uyarmak üzere bir araya HIV / SIV, ilaç tedavileri ve transloke mikropların etkilerine, uzun süreli değerlendirilmesi için önemlidir. MLN ve karaciğer GI Mikrobiyota maruz bağışıklık organlar çünkü Dahası, yetenek zaman içinde bu organlarda bağışıklığı değerlendirmek için mikrobiyomları konak immün dengesinin düzenlenmesinde rolünü anlamak için mükemmel bir platform sağlar. Birlikte ele alındığında, karaciğer değerlendirilmesi ve MLN aşısı ve terapötik etkinlik dereceleri, SIV viral hazne temizlenmesinde, ve genel mukoza bağışıklık bağlamında büyük önemi vardır. bir minimal invaziv bir yaklaşım ile bu numune toplama özelliğini şu anda yayınlanan teknikler ve hayvanların fizyolojisi üzerinde daha az etki ile var olan daha prosedürü ile ilgili inflamasyon daha az risk olduğu anlamına gelir. fuTure, biz önemli bir rol oynamaktadır gösterilmiştir bağışıklık sisteminin bir başka önemli ve belirgin bölümünün örnekleme için izin vermek aynı iki liman yerleri ile dalak koleksiyonu ile MLN'sinin toplanması ve karaciğer birleştirmek potansiyelini değerlendirecek hastalık modelleri bir dizi.
The authors have nothing to disclose.
Bu çalışma NIH hibe numarası P51OD010425 tarafından desteklenmiştir.
Artficial Tears Lubricant Ophthalmic Ointment | Patterson Veterinary | 97-890-8152 | |
Priority Care Chlorhexidine 2% Scrub | Patterson Veterinary | 07-842-6153 | |
Vedco Alcohol, Isopropyl 70% | Patterson Veterinary | 07-869-6434 | |
Vedco Vetadine Scrub | Patterson Veterinary | 07-869-6772 | |
Hospira Lactated Ringer's 250 ml | Patterson Veterinary | 07-800-9325 | |
Adolescent Laparotomy Surgical Drape | Medline | DYNJP3004 | |
Access 40 L Insufflator | Dyonics | 7205832 | |
300XL Xenon Light Source | Dyonics | 7206084 | |
460P 3 – CCD Digital Camera with Head | Dyonics | 72200086 | |
Universal Camera Drape, 7” x 96” | Endoscopy Support Services | ESS-6920 | |
Universal Light Guide, 7.5 Ft | Endoscopy Support Services | US.OU225 | |
Insufflator Tubing | Endoscopy Support Services | TM-102 | |
Multipurpose Rigid Scope, 2.7mm x 187.5mm, 0 degree | Endoscopy Support Services | B30-0007-00 | |
Exam and Protective Sheath for 2.7mm x 187.5mm scope with one fixed stopcock | Endoscopy Support Services | B10-0025-00 | |
Rigid scope, 5mm x 300mm | Endoscopy Support Services | B30-0071-00 | |
Veress Needle, 2mm x 80mm | Endoscopy Support Services | 8302.08 | |
Solid Probe with Markings, 5mm x 320mm | Endoscopy Support Services | 8383.661 | |
Maryland Grasping and Dissecting Forceps with Double Action Ratchet Handle, 3.5mm x 240mm | Endoscopy Support Services | 8390.2054 | |
Biopsy Forceps, 3.5mm X 310mm | R. Wolf | 8391.4063 | |
Plastic Threaded Cannula with Insufflator Port, 3.5mm x 60mm | Endoscopy Support Services | 8903.072 | |
Plastic Threaded Cannula with Insufflator Port, 5.5mm x 60mm | Endoscopy Support Services | 8919.333 | |
Blunt Tip Trocar | Endoscopy Support Services | 8903.101 | |
Pyramidal Tip Trocar | Endoscopy Support Services | 8903.121 | |
CO2 | Airgas | CD USPE | |
RPMI 1640 | Fisher Scientific | SH30027FS | with L-Glutamine |
RNAlater Stabilization Solution | ThermoFisher Scientific | AM7021 | |
Penicillin-Streptomycin | Sigma Aldrich | P4333 | |
Liberase TM Research Grade | Sigma Aldrich | 5401119001 | Commercially available colleganse solution |
Dnase I from bovine pancrease | Sigma Aldrich | D5025 | |
70 µm cell strainers | Morganville Scientific | CSS0200 | |
5mL Syringe | BD | 309646 | |
50mL Conical Centrifuge Tubes | ThermoFisher Scientific | 339652 | |
Fetal Bovine Serum | Fisher Scientific | SH3007003 | |
5mL Round-Bottom polystyrene tubes | Fisher Scientific | 14-959A | |
PBS | Fisher Scientific | SH3025601 | |
LIVE/DEAD Aqua Fixable Dead Cell Stain Kit | ThermoFisher Scientific | L34957 | Amine dead cell stain |
CD45-PerCP (clone D058-1283) | BD Biosciences | 558411 | |
PE-CF594 Mouse anti-Hu CD3 (clone SP34-2) | BD Biosciences | 562406 | |
BV605 Mouse Anti-Hu CD4 (clone OKT4) | Biolegend | 317438 | |
APC-H7 Mouse anti-Hu CD8 (clone SK1) | BD Biosciences | 560179 | |
PE-Cy5 Mouse Anti-Hu CD20 (clone 2H7) | BD Biosciences | 555624 | |
BV786 Mouse Anti-Hu CD14 (clone M5E2) | BD Biosciences | 563698 | |
16% PARAFORMALDEHYDE AQ SOLUTN | Fisher Scientific | 50-980-487 | |
LSR II Flow Cytometer | BD | NA |