Technique laparoscopiques pour la collecte série de noeuds du foie et mésentérique lymphatiques dans macaques

Les animaux ont été logés et soignés dans l'Association pour l'évaluation et l'accréditation des laboratoires de protection des animaux établissements agréés international (AAALACi), et toutes les procédures d'animaux ont été effectuées selon des protocoles approuvés par le Comité de protection des animaux institutionnels et utilisation (IACUC) de l'Université de Washington et Washington national Primate Research Center. 1. Préparation chirurgicale, anesthésie et analgésie Sédation et induction Sedate le macaque avec une injection intramusculaire de 10 mg / kg de kétamine et de 0,015 mg / kg de dexmédétomidine (combinés dans une seringue). Assurer l'absence de réflexes de retrait avant le retrait de la cage. Intuber l'animal, et de maintenir l'animal dans un plan de l'anesthésie générale en utilisant de l'isoflurane (1,0 à 2,5%) et 100% d'oxygène. Voir les références pour de plus amples informations concernant l' intubation et l' anesthésie générale chez les macaques 17,ref "> 18, 19. Soutien et suivi d'anesthésie Insérer un cathéter veineux périphérique et fournir des fluides isotoniques par voie intraveineuse (comme solution de Ringer Lactate) à raison de 5 ml / kg / h pendant l'anesthésie et la chirurgie. Appliquer du lubrifiant oculaire stérile pour prévenir la sécheresse de la cornée. Fournir une analgésie, par exemple une formulation à libération prolongée de la buprénorphine (0,2 mg / kg, voie sous-cutanée). REMARQUE: un AINS (tels que le méloxicam ou kétoprofène) peut également être prévu lors de la récupération anesthésique, à condition que le protocole expérimental permet l'administration d'AINS et que l'animal est normotendus et bien hydraté pendant l'anesthésie. Surveiller la profondeur d' anesthésie (par exemple la tonalité de la mâchoire), la fréquence cardiaque, le rythme respiratoire, électrocardiogramme, la pression artérielle, l' oxygénation de l' impulsion, à la fin de la marée CO 2, et la température du corps tout au long de l' anesthésie et la chirurgie. REMARQUE: Lorsque l'abdomen est insufflée, l'animal peut hypoventilate.Fournir une ventilation mécanique si le taux de respiration diminue, ou les 2 niveaux d'extrémité de marée de CO est supérieure à 45 mmHg. Après la chirurgie, l'administration d'atipamézole (0,15 mg / kg, par voie intramusculaire) pour l'inversion de la dexmédétomidine. Préparation chirurgicale Effectuer des lavements multiples de l' eau chaude pour réduire le volume des matières fécales dans le côlon pour faciliter la visualisation et la manipulation intestinale au cours de la procédure 20. Utilisez un coupe avec un numéro 40 lame pour enlever les poils du champ chirurgical. Rasez de la crête costale à la symphyse et de gauche à flanc droit. Aseptiquement préparer le champ opératoire à l'aide d'antiseptiques appropriés, tels que l'alternance des gommages chlorhexidine-alcool ou de povidone-iode à l'alcool. Placez l'animal sur la table d'opération sur son dos, à un angle à mi-chemin entre dorsal et décubitus latéral droit. Attacher les bras et les jambes avec une corde dans une position étendue. Fournir une chlorhexi finaledîner et préparation de l'alcool une fois l'animal se déplace vers la salle d'opération et est positionné pour la chirurgie. 2. Chirurgie Note: Pour plus d' informations de la coelioscopie chez les petits animaux, voir la référence 21. Laparoscopic Préparation de l'instrument Drapé l'animal avec un champ stérile fenêtré. Avec l'aide d'un assistant non stérile, envelopper l'appareil photo numérique avec le champ de la caméra stérile et fixer le câble à la tour. Attacher le cadre rigide à la tête de caméra. Attacher le câble de lumière stérile à la portée rigide et connecter le câble à la source lumineuse. Balance des blancs de l'appareil photo selon les instructions du fabricant. Fixer le tube de insufflateur stérile à l'insufflateur. Laparoscopic Entrée L'utilisation d'un scalpel # 15, faire une incision ~ poignarder 5 mm à travers la peau à la profondeur de la musculature abdominale, appenvi ron 1 – 2 cm à gauche de l'ombilic. Utilisation de la main non dominante, soulever le crâne de la paroi abdominale sur le site de l'incision. Avec la main dominante, placer la pointe de l'aiguille de Veress à travers l'incision et l'angle de la pointe crâniale. Remarque: L'angle de pénétration de l'aiguille de Veress varie en fonction de la condition corporelle de l'animal. Par exemple, chez un animal gras, l'aiguille Veress devra être inséré presque perpendiculaire à la paroi abdominale. Chez un animal mince, l'aiguille de Veress devrait être incliné crâniale pour réduire les risques de mise en contact des viscères. Maintenir l'arbre (non moyeu) de l'aiguille de Veress, pousser fermement l'aiguille pour pénétrer dans la paroi abdominale dans la cavité abdominale. A distinct « clic » et diminution de la résistance se fera sentir que la pointe acérée pénètre dans le péritoine et la pointe arrondie des ressorts à aiguille de Veress en avant dans la cavité abdominale. REMARQUE: Si l'aiguille passe correctement dans ee cavité abdominale, il y aura peu de résistance quand il est avancé et retiré 1 – 2 cm. Raccorder le tuyau d'insufflation CO 2 à l'aiguille et ouvrir le robinet d' arrêt. L'abdomen pour Pressuriser pas plus de 10 à 12 mmHg pour créer un pneumopéritoine. NOTE: L'abdomen a atteint idéal quand il insufflation a étendu de manière symétrique et il y a une perte du contour net normal des marges costaux. La pression devrait fournir un espace suffisant pour l'insertion de la canule / trocart sans risque de contact avec les viscères. placement canules Une fois que l'abdomen est complètement insufflée, faire une ~ 5 – incision 7 mm avec un n ° 15 lame de scalpel à travers la peau de l'abdomen gauche crânienne à la musculature abdominale ~ 2 – 4 cm caudal à la dernière côte. Placer un ensemble trocart-canule 5 mm à travers l'incision de la peau et de l'angle it ~ 45 – 60 degrés caudomedially. Pénétrer dans la cavité abdominale à une profondeur de 1-2 cm. Screw la canule filetée dans l'abdomen en faisant tourner la canule (~ 0,5 – 1 cm plus loin) à une profondeur de 1,5 – 3 cm, et retirer le trocart. Retirer le tube d'insufflation de l'aiguille de Veress, éteindre le robinet d'arrêt, et retirer l'aiguille. Raccorder le tuyau d'insufflation à la canule et ouvrir le robinet d'arrêt pour maintenir un pneumopéritoine à pas plus de 10 – 12 mm de Hg. Insérez le champ d'application rigide à travers la canule et dans la cavité abdominale. Sous la visualisation de la caméra, continuer à faire une petite incision avec un # 15 lame de scalpel à travers la musculature abdominale et du péritoine à l'incision cutanée précédente utilisée pour l'insertion de l'aiguille Veress. L'appareil est utilisé pour visualiser le côté de l'incision abdominale pour éviter les vaisseaux et minimiser les saignements. REMARQUE: Assurez-vous de l'incision dans le muscle et le péritoine est assez grand pour faciliter l'entrée de la sonde et extériorisation du mésentère (~ 0,5 cm). Une plus grande incision peut être nécessaire pour extérioriser mesentrès chez les animaux avec de la graisse mésentérique excessive. Placez l'animal dans la position déclive 21 avec les pieds surélevés à environ 15 – 30 degrés au- dessus de la tête. Cette option est facultative mais peut permettre un accès plus facile aux ganglions lymphatiques mésentériques du côlon, comme le petit tractus intestinal se déplace à une position plus crânienne. Mésentérique des ganglions lymphatiques Biopsie Dans le cadre de visualisation de la caméra, insérer une sonde solide à travers l'incision abdominale faite à l'étape 2.3.5. Placer la sonde entre l'épiploon et de l'intestin et en utilisant un mouvement de balayage pour balayer doucement l'épiploon de l'intestin pour permettre la visualisation du mésentère sous-jacent. En continuant d'utiliser le mouvement de balayage de la caudale à l'abdomen crânien. Le épiploon peut être placé dans l'abdomen crânienne droite de sorte qu'il est hors du champ opératoire. Utiliser la sonde pour déplacer le côlon descendant vers la paroi abdominale gauche ou à droite. Cela permettra une meilleure visualisation de til Mesentery pour aider à la recherche des ganglions lymphatiques mésentériques. Utiliser la sonde pour balayer à travers le mésentère pour localiser les ganglions lymphatiques mésentériques le long des vaisseaux du côlon et mésentériques. REMARQUE: les nœuds Côlon courent le long de la frontière mésentérique du côlon, des ganglions coliques gauche se trouve à proximité des points de branchement des vaisseaux et les ganglions mésentériques inférieurs se trouve le long des vaisseaux mésentériques inférieurs. ganglions lymphatiques mésentériques sont facilement visibles chez les animaux maigres. Enterré dans la graisse mésentérique ils prêtent souvent un peu élevé, l'apparence scintillante à la méso sus-jacente et peut-être plus une couleur tan plus grisâtres puis entourant la graisse mésentérique. En outre, les ganglions lymphatiques mésentériques ont tendance à se trouver le long des vaisseaux lymphatiques mésentériques et vascularisation. Une fois qu'un ganglion lymphatique est identifié, retirer la sonde et insérer la pince à cliquet Maryland dans la cavité abdominale. Utiliser la pince pour saisir le mésentère adjacent au noeud cible. Tirez le mésentère vers l'INCIsion, et supprimer le champ d'application de la canule. Éteignez l'insufflateur et laisser la canule ouverte pour dépressuriser robinet d'arrêt de l'abdomen pour faciliter extériorisation du mésentère. Tirez le mésentère extérieur du corps à travers l'incision. Une fois extériorisé, saisissez le mésentère avec hémostatiques anti-moustiques ou courbes pince pouce pour assurer l'accès à travers l'incision. Identifier le nœud lymphatique (s) dans le mésentère extériorisée par palpation pour le nœud lymphatique plus ferme et / ou la visualisation directe de la couleur grise ou l'aspect nodulaire du noeud lymphatique. Une fois identifié, effectuer une petite ouverture (~ 3 – 5 mm) dans le mésentère près du nœud à l'aide des pinces hémostatiques courbes. pièces jointes gratuites au mésentère en utilisant la dissection émoussé avec les hémostatiques courbes. Ligaturer la vasculature avec 4-0 suture monofilament non résorbable au besoin. Utilisation dissection avec un scalpel pour enlever les ganglions lymphatiques. Placez les noeuds dans Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 surla glace. Examinez le mésentère extériorisé pour des saignements. Si le saignement est noté, fournir hémostatique approprié en bouchant les vaisseaux avec hémostatiques ou ligatures (4-0 de suture monofilament non résorbable), ou par l'utilisation de cautérisation. Relâchez le mésentère et insufflera l'abdomen retour à 10 – 12 mm Hg pour permettre au mésentère de revenir à la cavité abdominale. Répéter les étapes 2.4.1 à travers 2.4.8 pour obtenir des biopsies de ganglions lymphatiques supplémentaires. biopsie du foie Retour à la table en position horizontale. Placer une canule filetée dans l'abdomen à travers l'incision précédemment utilisé pour la collecte de biopsie des ganglions lymphatiques (incision faite dans l'étape 2.3.5). Assurez-vous de l'incision est assez grand (~ 5 – 7 mm) pour permettre le placement de la canule sans insertion de trocart. Insérez le champ d'application rigide à travers cette canule vers la cavité abdominale du crâne et de visualiser l'abdomen du crâne et du foie. Dans le cadre de visualisation de la caméra, insérer la biopsie forceps à travers la canule précédemment placés dans l'abdomen cranial gauche (incision faite dans l'étape 2.3.1). Pour obtenir des biopsies du foie, placer les pinces à biopsie sous la marge de lobe du foie sélectionné avec la partie mobile de la mâchoire tournée vers le foie, ouvrir la pince, et de permettre la marge de tomber entre les mâchoires ouvertes. Veiller à ce qu'aucun épiploon est entre le foie et une pince à biopsie. Ajuster la position de la pince et fermer l'instrument au-dessus de la zone d'échantillon souhaitée. Maintenir la pression pendant environ 20 – 30 s pour assurer hémostatique. Avec la pince fermée, retirer l'échantillon en tirant doucement sur la pince à travers la canule. Ceci doucement déchirer la biopsie du foie. Placer des biopsies du foie dans du milieu RPMI 1640 sur de la glace. REMARQUE: La taille de la biopsie du foie est d'environ 5 mm x 2 mm x 2 mm à l'aide de 5 mm de forceps de biopsie. Examinez le site de biopsie pour une hémorragie en utilisant la visualisation de la caméra. Si l'hémorragie est observée, placez une moistene salined coton-tige stérile à travers la canule et appliquer une pression sur le site de biopsie. En variante, emballer les sites de biopsie avec la mousse de gel stérile pour faciliter l'hémostase. Répétez les étapes 2.5.3 à travers 2.5.5 pour obtenir des biopsies hépatiques supplémentaires. REMARQUE: Ici, 3 biopsies par animal et par procédure ont été recueillies, ce qui est suffisant pour toutes les analyses en aval. Fermeture chirurgicale Examinez la cavité abdominale pour des saignements. NOTE: Cela n'a pas eu lieu à ce jour. Cependant, si le saignement excessif est noté, déterminer le site de l'hémorragie et de fournir une hémostase appropriée par l'intermédiaire d'une pression avec des tampons de coton stériles ou l'utilisation d'une mousse de gel. Éteignez l'insufflateur et ouvrez la canule robinets d'arrêt. Appliquer une légère pression manuelle sur l'abdomen pour dépressuriser complètement la cavité péritonéale. Retirez les canules. Fermez chacune des incisions de la paroi abdominale avec 1 à 2 simples sutures interrompues par site. 4-0 suture absorbable est recommandé. Effectuer un bloc de démarrage en plaçant bupivacaïne 0,1-0,3 cc dans chaque incision pour l'analgésie locale avant la fermeture de la peau. Fermez la peau avec 1 – 2 enterrées sutures interrompues (4-0 suture absorbable est recommandé) par site. colle tissulaire peut être appliquée. 3. Traitement et biopsie du foie lymphocytaire Analyse Magasin plusieurs morceaux de tissu de foie (environ 0,5 mm x 0,5 mm x 0,5 mm de diamètre) dans des tubes de cryoconservation, dans une solution de stockage de l'ARN préféré, et 10% de formaline pour l'avenir moléculaire et l'analyse histologique. Placer les biopsies du foie restant dans 50 ml de milieu RPMI 1640 additionné de 1 x pénicilline / streptomycine, 40 pg / ml d'une solution de collagénase disponible dans le commerce, et 4 pg / ml de DNase dans une tasse de 250 ml en plastique stérile avec un couvercle. On agite vigoureusement en utilisant un barreau d'agitation magnétique et d'une plaque d'agitation pendant 1 h à 37 ° C. répartir en versant le tissu digéré. Grind le tissu digéré (étape 3.1.1) sur deux filtres de 70 pm insèrent dans deux tubes coniques de 50 ml dans une suspension de cellules individuelles en utilisant l'extrémité d'une seringue stérile de 5 ml. Amener le volume des deux tubes de 50 ml dans du milieu RPMI 1640 additionné de 10% de sérum bovin fœtal et 1 x pénicilline / streptomycine (R10). Centrifuger les cellules à 840 g pendant 6 min à 4 ° C. Décanter le surnageant. Concentrer les cellules dans un tube conique de 50 ml en mettant en suspension les cellules à partir des deux tubes dans 5 ml de R10 et de combinaison dans un tube conique de 50 ml. Amener le volume à 50 ml en utilisant R10. Nombre de cellules en utilisant un hémocytomètre pour déterminer le rendement cellulaire. Centrifuger les cellules à 840 g pendant 6 min à 4 ° C. Remettre en suspension les cellules dans 1 ml de R10, répartir en deux tubes de 5 ml en polystyrène à fond rond et à amener le volume de chaque tube de 4 ml avec R10, pour le ciblage> 500.000 cellules dans chaque tube. Centrifuger les cellules à 840 g pendant 6 min à 4 ° C. Décanter les supernatant et remettre en suspension le culot de cellules dans 4 ml de solution saline tamponnée au phosphate (PBS). Centrifuger à 840 g pendant 6 min à 4 ° C. Décanter le surnageant et remettre en suspension les cellules dans 100 ul de PBS par agitation par tourbillonnement doucement. Ajouter 1,5 ul d'une tache de cellules mortes réparable. Incuber à température ambiante pendant 5 min. Ajouter les anticorps de coloration de surface non dilué suivants dans les titres recommandés par le fabricant: CD45-PerCP (de D058-1283 clone), CD3-PE-CF594 (clone SP34-2), CD20-PE-Cyanin5 (clone 2H7), CD4-BV605 ( OKT4 clone), CD8-BV570 (clone RPA-T8), et CD14-BV785 (clone M5E2). Incuber à 4 ° C pendant 20 min. Ajouter 4 ml de PBS et centrifuger à 840 g pendant 6 min à 4 ° C. Décanter le surnageant et remettre en suspension les cellules dans 250 ul de 1% de paraformaldehyde dans du PBS. Attention: paraformaldéhyde est toxique. Porter un équipement de protection individuelle approprié. Analyser les populations cellulaires en utilisant un cytomètre de flux comme décrit en référence 22.