Summary

リコンビナーゼ媒介カセット交換を用いて、マウス胚性幹細胞における構造と機能の研究

Published: April 27, 2017
doi:

Summary

タンパク質は、多くの場合、異なる細胞機能を発揮することができ、複数のドメインを含みます。遺伝子ノックアウト(KO)は、この機能的多様性を考慮していません。ここでは、様々な機能ドメインまたはタンパク質の変異体の分子解剖を可能KO胚性幹細胞における組み換え媒介カセット交換(RMCE)ベースの構造と機能のアプローチを報告しています。

Abstract

マウスの胚または胚性幹細胞における遺伝子工学(たmESC)は、与えられたタンパク質の機能を研究することができます。タンパク質は、細胞の主力であり、しばしば翻訳後修飾によって影響を受けることができる複数の機能ドメインからなります。条件付きまたは構成ノックアウト(KO)マウスでは、全タンパク質の枯渇を考慮に入れ、この機能的多様性と規制を負いません。 MESCラインとFLPe組換え媒介カセット交換(RMCE)のためのドッキング部位がROSA26(R26)遺伝子座内に挿入された誘導されたマウスモデルは、以前に報告されました。ここでは、マルチドメインタンパク質の異なる機能の分子解剖することができます構造 – 機能アプローチについて報告します。このため、RMCE互換マウスは、KOマウスと交配されている必要があり、その後、RMCE互換KOたmESCを分離する必要があります。次に、推定レスキュー構築物のパネルは、RMCE targetiを介してR26遺伝子座に導入することができますNG。候補レスキューcDNAを容易組換えクローニングを使用してターゲティングベクターのRMCE部位の間に挿入することができます。次に、KOのたmESCはFLPeリコンビナーゼ発現プラスミドと組み合わせたターゲティングベクターでトランスフェクトされます。 RMCEは、ROSA26ドッキング部位でプロモーターレスネオマイシン耐性遺伝子を再活性化し、正しい標的化事象の選択を可能にします。このように、100%に近い高いターゲティング効率は、半高スループット様式での複数の推定レスキュー構築物の挿入を可能にする、得られます。最後に、R26駆動型救助構築物の多くは、親のKOたmESCで観察された表現型を救出する能力について試験することができます。私たちは、P120カテニン(p120ctn)表現型の読み出しとして胚様体(EB)中胚葉分化を使用してのKOたmESCにおける実証の原則構造と機能の研究を提示します。このアプローチは、重要なドメイン、推定下流経路、および疾患関連点の識別を可能にします与えられたタンパク質のためのKO表現型の基礎となる変異。

Introduction

哺乳動物のゲノムは、約20,000のタンパク質をコードする遺伝子が含まれていると推定されています。選択的スプライシングと翻訳後修飾は、さらに、タンパク質のレパートリーを増やします。タンパク質は、モジュラー構造1を有し、しばしば、異なるタンパク質複合体へのそれらの動員および複数の細胞プロセス2への参加を可能にする、複数の相互作用ドメインを含みます。一つの例は、p120ctnと呼ばれる多機能性タンパク質です。 p120ctnはCtnnd1遺伝子によってコードされ、N末端およびC末端領域によって隣接大きな中央アルマジロリピートドメインから構成されています。 p120ctnのアルマジロドメインは、細胞 – 細胞接着に関与している古典的カドヘリンの高度に保存された膜近傍ドメインに結合し、それはまた、転写リプレッサーKaisoに結合します。 p120ctnのN末端ドメインは、異なるキナーゼ、ホスファターゼ、小さなRhoGTPases、及び微小管関連Pと相互作用しますroteins 3。興味深いことに、選択的スプライシングの結果として、p120ctnアイソフォームは、4つの代替開始コドン4から生成することができます。それは最も5' 開始コドンから翻訳および全長N末端セグメントを含むようp120ctnアイソフォーム1Aは、最長です。 p120ctnアイソフォーム3および図4に、このN末端セグメントは、それぞれ、部分的におよび完全に削除されます。さまざまな細胞機能におけるタンパク質(またはタンパク質アイソフォーム)とそのドメインの正確な役割を理解することが課題です。

たmESCにおいて標的遺伝子は、対応する遺伝子の遺伝子欠失を介してタンパク質の機能の研究を可能にし、広く発達重要と疾患関連遺伝子および経路の同定に貢献しています。逆遺伝学では、この画期的なによる相同組換え5にMESC単離及び標的遺伝子の分野における進歩の結果でした</s>アップ。相同組換えは、DNAフラグメントが二本鎖(ds)DNA切断後に2つの類似または同一の核酸部分との間で交換されるプロセスです。二本鎖DNA切断が頻繁であるため、通常、HRは非効率的です。最近、標的相同性指向性遺伝子の効率は、部位特異的ヌクレアーゼ6,7用いて増加させることができるが、残念ながら、これらは、オフターゲット効果8を受けやすいです。遺伝子ターゲティングを可能にするためのより信頼性の高い技術は、のCre / loxP配列又はFLPe / FRTなどの部位特異的組換え系に基づいているRMCE、です。 LoxP及びFRT配列は、 バクテリオファージP1で発見され、 サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)は 、それぞれ、サイトの向きを決定非対称8塩基対の配列を含む、34塩基対から成ります。例えば、DNAストレッチ内の2つのloxP部位は、flox化DNAを切除またはIとなるかどうかを決定する一方、配向のCre媒介組み換え9時nversed。二つの部位が異なる染色体上に位置している場合また、Creをも転位を誘導することができます。 RMCEは、クロス反応し、ゲノム遺伝子座に埋め込まれていない異種の組換え部位を利用しています。同じ異種部位に隣接するDNA断片を含有するドナープラスミドの存在下で、リコンビナーゼは、なぜなら、二重同時トランスロケーション( 図1)のRMCE互換ゲノム遺伝子座にこのDNA断片を挿入します。ここで、のみ正しくRMCE標的クローンをドッキング細胞のR26ゲノム中に存在する「捕捉された、」プロモーターレスネオマイシン耐性遺伝子(ネオR)を復元着信ベクター上のプロモーター( 図1)に対する薬剤耐性のおかげをレンダリングすることができ10、11。これは、<100%11しばしば近く、非常に高いターゲティング効率をもたらします/ SUP> 12。結論として、RMCEベースのターゲティングは非常に効率的であり、構造機能研究のために使用することができます。しかし、それは事前設計ゲノム遺伝子座を必要とします。

図1
図1. RMCE媒介ターゲティングの略図。両方は、2つの異種FRT部位(白及び赤の三角形によって示される)を保有する場合RMCEは、定義されたゲノム遺伝子座への着信ターゲティングベクターからのDNAセグメントの交換を可能にします。加えて、操作されたゲノム遺伝子座は、プロモーターおよび短縮型ネオマイシン耐性(ネオR)遺伝子を含みます。プロモーターを提供することによってのみ正しい組換え事象は、高いターゲティング効率で得られ、ネオマイシン耐性を復元する、入ってくるDNA断片に開始コドン。 トンの拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。彼のフィギュア。

たmESCにおけるゲノム工学は、RMCE互換マウスの生成を可能にします。 1981年に、2つのグループが胚盤胞の内部細胞塊(ICM)から多能性細胞を捕捉及び培養13、14でそれらを維持することに成功しました。たmESCは、生殖細胞系列を含む、胚および成人の細胞のすべてのタイプの中に自己複製と分化することができます。したがって、たmESCにおいて標的遺伝子(のCre / loxPシステムを使用して)構成的または条件付きKOマウスの開発を通して逆遺伝学的研究を可能にします。しかし、マウスES細胞を分離するための古典的な方法は非常に非効率的です。いくつかの主要な改良が大幅MESC SRとウシ胎児血清(FBS)16を含有する培地、及び薬理学の使用の間に交互に、15培地(SR)に定義血清置換の使用を含む、MESCラインを導出するための成功率が増加しています例えばpluripotin又は2I 17などの論理化合物。 Pluripotin、小さな合成分子は、白血病阻害因子(LIF)およびマウス胚線維芽細胞(MEFの)18の非存在下で未分化状態におけるたmESCの伝播を可能にします。最後に、SR / FBS培地交替プロトコルはLIFと19、20 pluripotin組み合わせた場合たmESCは(100%に近い)非常に高い効率で単離することができることが示されています。これらのプロトコルは、その後、構造 – 機能研究のために使用することができるRMCE互換ノックアウトたmESCの効率的な分離を可能にします。

本論文では、特定の細胞プロセスに責任があるタンパク質内のキーのドメインまたは残基を同定するために、1つを可能にする方法を説明します。この目的のために、効率的MESC分離を有効に高度な技術、ターゲティングベクターのアセンブリ、およびMESCターゲティングのパイプラインを作成しましたD。このようにして、タンパク質アイソフォーム、ドメイン変異体、および下流のエフェクターとの大きなパネルがKOされたmESCで導入することができ、in vitroでの KO表現型を救出する能力について評価することができます。

Protocol

マウス上の全ての実験は、機関投資家、国、ヨーロッパの動物の規定に従って行われました。 RMCE互換KOたmESCの単離そのようなROSALUCマウス10またはROSA26-のiPSCマウス21などのRMCE互換マウスとヘテロ接合性KOマウスを繁殖。両方のRMCE互換マウスは、混合129 / C57BL6 /スイスの背景上で維持しました。 注:ヘテロKOマウスとの交配は、ホモ接合型K…

Representative Results

RMCE互換KO MESC株を単離するための手順は、図2に示されています。二つの連続交配はRMCE互換KO胚盤胞を得るために必要とされています。まず、ヘテロKOマウスはRMCE互換、ヘテロKOマウスを得ることがRMCE互換のマウスと交配されています。これらのマウスは、次いでRMCE互換3.5 DPC、ホモ接合型KO胚盤胞を得るために、他のヘテロ接合性KOマウスとの時限交配の?…

Discussion

私たちのMESC分離法は、ユーザーフレンドリーであり、そのような胚盤胞のマイクロサージェリーなどの高度なスキルや設備を必要としません。したがって、この技術は、科学界の大部分にアクセスできます。基本的な細胞培養の経験を持つ誰もがICMの派生物を伝播したmESCラインを確立することができます。しかし、胚盤胞の洗浄及び取り扱いはいくつかの練習が必要です。口のピペットは?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

私たちは、その優れた技術サポートのためにJinke D'Hont、フレデリック・ヴァン・Rockeghem、ナタリーFarla、ケリー・レメアー、およびRietデRyckeに感謝します。我々はまた、彼らの専門家の支援のための炎症研究センターのバイオイメージングコア施設からEEF Parthoens、EvelienヴァンHamme、およびアマンダGoncalvesの感謝します。私たちは貴重な議論のための私たちの研究グループのメンバーを認めます。この作品は、ベルギーの科学政策によってサポートされていました(Belspo大学間アトラクションのポーランド – 賞IAP VII-07 DevRepair; https://devrepair.be)エリザベート王妃医療財団、ベルギー(GSKE 2008年から2010年で、;のhttp:// WWW .fmre-gske.be)、およびゲント大学、ベルギー(http://www.ugent.be/en/ghentuniv)の協調研究アクション(GOA 01G01908)によります。 SGフランダース研究費(FWO-V)のポスドクです。

Materials

ROSALUC Mice made in house frozen sperm available upon request
R26-iPSC mice made in house frozen sperm available upon request
Vessel probe Fine Science Tools 10160-13 to check for copulation plugs
M2 medium Sigma-Aldrich M7167 make aliquots and store at -20°C
Fine forceps (Dumont #5 Standard tip Student forceps) Fine Science Tools 11251-10 spray with 70% EtOH before use (do not autoclave)
23G needles Fine-ject 8697
1-ml syringes Soft-ject 6680
60-mm bacterial grade plates (for flushing)  Gosselin BB60-01
Mouth pipette made in house see discussion
Mouse embryonic fibroblasts (MEFs, TgN (DR4)1 Jae strain) ATTC SCRC-1045
TgN (DR4)1 Jae mice The Jackson Laboratory 3208
Mitomycin C  Sigma-Aldrich M0503
Phosphate buffered saline (PBS) without calcium or magnesium Gibco 14190-094
Tg(DR4)1Jae/J mice JAX 3208 mice that contain four drug-selectable genes and DR4 MEFS confers resistance to neomycin, puromycin, hygromycin and 6-thioguanine
0.1% Gelatin Sigma-Aldrich G1393 Dissolve 0.5 g in 500 ml distilled water, autoclave and store at 4°C.
Trypsin (0.25%)  Gibco 25200-056
2 μM pluripotin Cayman Chemical 10009557
pRMCE-DV1 BCCM/LMBP collection  LMBP 08870 public available from the BCCM/LMBP collection (http://bccm.belspo.be) 
cre-excised pRMCE-DV1 BCCM/LMBP collection  LMBP 08195 public available from the BCCM/LMBP collection (http://bccm.belspo.be) 
pCAG-FlpE-IRES-Puro-pA  Addgene 20733
heat-shock competent DH5α bacteria  made in house
Gateway pDONR221 vector Thermo Fisher 12536-017 contains kanamycin-resistance gene
BP clonase II mix Thermo Fisher 11789-020
LR clonase II mix Thermo Fisher 11791-020 
Luria Broth (LB) 
Ampicillin 
Applied Biosystems 3730XL DNA Analyzer Thermo Fisher 3730XL
G418 Thermo Fisher 11811-023
Lipofectamine 2000 transfection reagent Thermo Fisher 11668027
Lipofectamine LTX transfection reagent Thermo Fisher 15338100
Effectene transfection reagent Qiagen 301425
GATEWAY pENTR 1A vector Thermo Fisher A10462 recombination-compatible vector
mouse monoclonal anti-p120ctn antibody BD Transduction Laboratories 610134
mouse monoclonal anti-Ecadherin antibody BD Transduction Laboratories 610181
General equipment:
Sterile dissection tools fine scissors and forceps for dissecting the uterus
Sterile pipettes: 5 ml, 10 ml and 25 ml
15-ml and 50-ml conical centrifuge tubes
96-well culture plates V-shaped bottom and flat bottom) 
Culture dishes: 24 wells, 12 wells and 6 wells
Multichannel pipettes (to pipette 30, 50, 100 and 200 μl) 
Sterile multichannel reservoirs
Access to a laminar air flow
Access to an incubator at 37°C with 5% CO2
Access to an inverted microscope
Access to a bench-top centrifuge
Access to a stereo microscope with transmitted-light 
Culture media:
MEF Medium: stored at 4°C; warm 30 min at 37°C before use
 Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) Gibco 41965-062
10% fetal bovine serum (FBS) Sigma-Aldrich F-7524
L-glutamine (2 mM) Gibco 25030-024 
Sodium pyruvate  (0.4 mM) Gibco 11360-039 
penicillin (100 U/ml) Gibco 15140-122 
streptomycin (100 µg/ml) Gibco 15140-122 
SR-based mESC medium: stored at 4°C; warm 30 min at 37°C before use
DMEM/F12 Gibco 31330-038 mixed in a 1:1 ratio
15% knock-out serum replacement (SR ) Gibco 10828–028
L-glutamine (2 mM) Gibco 25030-024 
0.1 mM non-essential amino acids  Gibco 11140-050
penicillin (100 U/ml) Gibco 15140-122 
streptomycin (100 µg/ml) Gibco 15140-122 
β-mercaptoethanol (0.1 mM)  Sigma-Aldrich M 3148 
2,000 U/ml recombinant mouse LIF  (IRC/VIB Protein Service facility)
FBS-based mESC medium (similar to SR-based mESC medium): stored at 4°C; warm 30 min at 37°C before use
Knockout DMEM Gibco 10829-018 
15% FBS Hyclone SH30070.03E
Differention Medium stored at 4°C; warm 30 min at 37°C before use
Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) Gibco 21980-032 
15% FBS Hyclone SH30070.03E
5% CD Hybridoma Medium(1x) liquid   Gibco 11279-023 
 2 mM L-glutamine Gibco 25030-024 
0.4 mM 1-thioglycerol Sigma-Aldrich M-6145
50 μg/ml ascorbic acid Sigma-Aldrich A-4544 
penicillin (100 U/ml) Gibco 15140-122 
streptomycin (100 µg/ml) Gibco 15140-122 
2i
1 μM Erk inhibitor PD0325901  Axon Medchem Axon 1408
3 μM Gsk3 inhibitor CHIR99021 Axon Medchem Axon 1386

References

  1. Gul, I. S., Hulpiau, P., Saeys, Y., van Roy, F. Metazoan evolution of the armadillo repeat superfamily. Cell Mol Life Sci. , (2016).
  2. Valenta, T., Hausmann, G., Basler, K. The many faces and functions of beta-catenin. EMBO J. 31, 2714-2736 (2012).
  3. Pieters, T., van Hengel, J., van Roy, F. Functions of p120ctn in development and disease. Front Biosci. 17, 760-783 (2012).
  4. Keirsebilck, A., et al. Molecular cloning of the human p120ctn catenin gene (CTNND1): Expression of multiple alternatively spliced isoforms. Genomics. 50, 129-146 (1998).
  5. Capecchi, M. R. Gene targeting in mice: functional analysis of the mammalian genome for the twenty-first century. Nat Rev Genet. 6, 507-512 (2005).
  6. Wang, H., et al. One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 153, 910-918 (2013).
  7. Yang, H., et al. One-step generation of mice carrying reporter and conditional alleles by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 154, 1370-1379 (2013).
  8. Fu, Y., et al. High-frequency off-target mutagenesis induced by CRISPR-Cas nucleases in human cells. Nat Biotechnol. 31, 822-826 (2013).
  9. Branda, C. S., Dymecki, S. M. Talking about a revolution: The impact of site-specific recombinases on genetic analyses in mice. Dev Cell. 6, 7-28 (2004).
  10. Sandhu, U., et al. Strict control of transgene expression in a mouse model for sensitive biological applications based on RMCE compatible ES cells. Nucleic Acids Res. 39, 1 (2010).
  11. Haenebalcke, L., et al. Efficient ROSA26-based conditional and/or inducible transgenesis using RMCE-compatible F1 hybrid mouse embryonic stem cells. Stem Cell Rev. 9, 774-785 (2013).
  12. Pieters, T., et al. p120 Catenin-Mediated Stabilization of E-Cadherin Is Essential for Primitive Endoderm Specification. PLoS Genet. 12, e1006243 (2016).
  13. Evans, M. J., Kaufman, M. H. Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos. Nature. 292, 154-156 (1981).
  14. Martin, G. R. Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryos cultured in medium conditioned by teratocarcinoma stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 78, 7634-7638 (1981).
  15. Cheng, J., Dutra, A., Takesono, A., Garrett-Beal, L., Schwartzberg, P. L. Improved generation of C57BL/6J mouse embryonic stem cells in a defined serum-free media. Genesis. 39, 100-104 (2004).
  16. Bryja, V., et al. An efficient method for the derivation of mouse embryonic stem cells. Stem Cells. 24, 844-849 (2006).
  17. Ying, Q. L., et al. The ground state of embryonic stem cell self-renewal. Nature. 453, 519-523 (2008).
  18. Chen, S., et al. Self-renewal of embryonic stem cells by a small molecule. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 17266-17271 (2006).
  19. Pieters, T., et al. Efficient and User-Friendly Pluripotin-based Derivation of Mouse Embryonic Stem Cells. Stem Cell Rev. 8, (2012).
  20. Yang, W., et al. Pluripotin combined with leukemia inhibitory factor greatly promotes the derivation of embryonic stem cell lines from refractory strains. Stem Cells. 27, 383-389 (2009).
  21. Haenebalcke, L., et al. The ROSA26-iPSC Mouse: A Conditional, Inducible, and Exchangeable Resource for Studying Cellular (De)Differentiation. Cell Rep. 3, (2013).
  22. Tucker, K. L., Wang, Y., Dausman, J., Jaenisch, R. A transgenic mouse strain expressing four drug-selectable marker genes. Nucleic Acids Res. 25, 3745-3746 (1997).
  23. Nyabi, O., et al. Efficient mouse transgenesis using Gateway-compatible ROSA26 locus targeting vectors and F1 hybrid ES cells. Nucleic Acids Res. 37, 55 (2009).
  24. Katzen, F. Gateway((R)) recombinational cloning: a biological operating system. Expert Opin Drug Discov. 2, 571-589 (2007).
  25. Schaft, J., Ashery-Padan, R., vander Hoeven, F., Gruss, P., Stewart, A. F. Efficient FLP recombination in mouse ES cells and oocytes. Genesis. 31, 6-10 (2001).
  26. Spencer, H. L., et al. E-cadherin inhibits cell surface localization of the pro-migratory 5T4 oncofetal antigen in mouse embryonic stem cells. Mol Biol Cell. 18, 2838-2851 (2007).
  27. Stryjewska, A., et al. Zeb2 Regulates Cell Fate at the Exit from Epiblast State in Mouse Embryonic Stem Cells. Stem Cells. , (2016).
  28. Nagy, A., Gertsenstein, M., Vintersten, K., Behringer, R. . Manipulating the mouse embryo: A laboratory manual. , (2003).
  29. van den Berghe, V., et al. Directed migration of cortical interneurons depends on the cell-autonomous action of Sip1. Neuron. 77, 70-82 (2013).
  30. Li, J., et al. The EMT transcription factor Zeb2 controls adult murine hematopoietic differentiation by regulating cytokine signaling. Blood. , (2016).

Play Video

Cite This Article
Pieters, T., Haenebalcke, L., Bruneel, K., Vandamme, N., Hochepied, T., van Hengel, J., Wirth, D., Berx, G., Haigh, J. J., van Roy, F., Goossens, S. Structure-function Studies in Mouse Embryonic Stem Cells Using Recombinase-mediated Cassette Exchange. J. Vis. Exp. (122), e55575, doi:10.3791/55575 (2017).

View Video