Summary

מחקרי מבנה-תפקוד תאי גזע עוברי עכבר שימוש recombinase בתיווך Exchange קסטה

Published: April 27, 2017
doi:

Summary

חלבונים בדרך כלל מכילים מספר תחומים שיכולים להפעיל פונקציות סלולריות שונות. ג'ין לדפוק-outs (KO) לא מחשיב מגוון תפקודי זו. כאן, אנו מדווחים חילופי קלטת בתיווך רקומבינציה (RMCE) גישת מבנה-תפקוד מבוסס בתאי גזע עוברי KO המאפשרת דיסקציה המולקולרי של תחומים או הגירסות פונקציונליים השונים של חלבון.

Abstract

הנדסת גנים עוברים עכברים או תאי גזע עובריים (mESCs) מאפשרת לחקר הפונקציה של חלבון נתון. חלבונים הם סוסי העבודה של התא ולעתים קרובות כוללים תחומים פונקציונליים מרובים, אשר יכול להיות מושפע שינויים posttranslational. הדלדול של החלבון השלם עכברים מותנה או מכונן נוק-אאוט (KO) אינו לוקח בחשבון זה גיוון תקנה פונקציונלי. קו המסקלין במודל עכברי נגזר, שבו אתר עגינה עבור חילופי קלטת בתיווך רקומבינציה FLPe (RMCE) הוכנס בתוך הלוקוס ROSA26 (R26), דווחו בעבר. כאן, אנו מדווחים על גישת מבנה-תפקוד המאפשרת דיסקציה מולקולרי של הפונקציות השונות של חלבון multidomain. לשם כך, העכברים RMCE תואם חייב להיות חצה עם עכברים KO ואז mESCs RMCE תואם KO חייב להיות מבודד. הבא, פנל של מבני הצלה משוערים יכול להיות מוחדר לוקוס R26 באמצעות RMCE targeting. CDNAs הצלת המועמד ניתן להוסיף בקלות בין אתרי RMCE של וקטור המיקוד באמצעות שיבוט רקומבינציה. הבא, mESCs KO הם transfected עם וקטור מיקוד בשילוב עם פלסמיד ביטוי recombinase FLPe. RMCE reactivates גן neomycin-התנגדות פחות האמרגן של אתרי עגינת ROSA26 ומאפשר את הבחירה של אירוע הנכון למיקוד. בדרך זו, התייעלות מיקוד גבוה קרובה 100% מתקבלות, המאפשרת החדרה של מבני הצלה משוערים מרובים באופן תפוקה למחצה גבוה. לבסוף, מספר רב של מבני הצלת מונחת R26 יכול להיבדק על יכולת להציל את הפנוטיפ כי נצפה mESCs הורית KO. אנו מציגים מחקר הוכחה של עקרון מבנה-תפקוד ב קטנין P120 (p120ctn) mESCs KO באמצעות בידול endoderm ב גופים embryoid (EBS) כמו את ההודעה פנוטיפי. גישה זו מאפשרת זיהוי של תחומים חשובים, מסלולים במורד משוערים, ונקודת מחלה רלוונטיתמוטציות העומדים בבסיס פנוטיפים KO עבור חלבון נתון.

Introduction

הערכה היא כי הגנום יונק מכיל כ 20,000 גנים המקודדים לחלבונים. שחבור אלטרנטיבי ושינויי posttranslational להגביר עוד יותר את רפרטואר החלבון. יש חלבוני מבנה מודולרי 1 ולעתים קרובות מכילים תחומי אינטראקציה מרובים, המאפשרים הגיוס שלהם לתוך מתחמי חלבון שונים השתתפותם תהליכים תאיים רבים 2. דוגמה אחת היא חלבון רב תפקודי הנקרא p120ctn. p120ctn מקודד על ידי הגן Ctnnd1 ו מורכב מתחום חוזרים ארמדיל מרכזי גדול ולצידו ידי N-מסוף אזור הטרמינל-C. התחום ארמדיל של p120ctn נקשר לתחום juxtamembrane השמור ביותר של cadherins הקלסית, אשר מעורבים תאי תאי הידבקות, אבל זה גם נקשר מדכא תעתיק Kaiso. התחום מסוף-N של p120ctn אינטראקציה עם קינאזות שונות, phosphatases, RhoGTPases קטן, ו- p-מזוהה microtubuleroteins 3. מעניין, כתוצאה של שחבור חלופי, isoforms p120ctn ניתן להפיק ארבעה קודונים התחלה חלופה 4. 1A איזופורם p120ctn הוא הארוך ביותר, כפי שהוא מתורגם מן-5 ביותר להתחיל קודון ומכיל קטע באורך מלא N-terminal. בשנת p120ctn isoforms 3 ו 4, זה קטע N-terminal נמחק חלקית לחלוטין, בהתאמה. הבנת התפקיד המדויק של חלבונים (או isoforms חלבון) ועל התחומים שלהם פונקציות סלולריות שונות עדיין מהווה אתגר.

ג'ין מיקוד mESCs מאפשר הלימוד של הפונקציה של חלבון דרך המחיקה הגנטית של הגן המתאים ואת תרם רב לזיהוי גנים ושבילים התפתחותית חשובים ומחל-רלוונטיות. זו פריצת דרך גנטיקה הפוכה הייתה התוצאה של התקדמות בתחומי בידוד המסקלין ואת גן המיקוד בשל הומולוגי 5 </sעד>. הומולוגיים הוא תהליך שבו שברי DNA הם החליפו בין שני moieties גרעין דומה או זהה לאחר הפסקות פעמיים גדילי דנ"א (DS). בדרך כלל, HR אינו יעיל משום הפסקות dsDNA הן נדירות. לאחרונה, את היעילות של גנים בבימויו הומולוגית מיקוד יכולה להיות מוגברת באמצעות nucleases ספציפי באתר 6, 7, אבל לצערי, אלה נוטים השפעות חוץ-יעד 8. טכניקה אמינה יותר כדי לאפשר גן המיקוד הוא RMCE, אשר מבוססת על מערכות רקומבינציה ספציפי באתר כגון Cre / loxP או FLPe / FRT. LoxP ורצף FRT נמצאים P1 בקטריופאג ו שמר האפייה, בהתאמה, וכוללת 34 נ"ב, כולל רצף BP אסימטרי 8 הקובע את הכיוון של האתר. מצד השני, את הכיוון של, למשל, שני אתרי loxP בתוך מתיחת DNA יקבעו אם הדנ"א floxed הופך ניכר או inversed על רקומבינציה 9 בתיווך Cre. יתר על כן, Cre יכול גם לגרום טרנסלוקציה אם שני האתרים נמצאים על כרומוזומים שונים. RMCE מנצל אתרי רקומבינציה heterospecific כי לא צולב להגיב וכי מוטבעי מוקד הגנומי. בנוכחות פלסמיד התורם המכיל קטע DNA מוקף באותם אתרים heterospecific, את recombinase יוסיף קטע DNA הזה לתוך לוקוס גנומית תואם RMCE בגלל טרנסלוקציה פעמיים סימולטני (איור 1). הנה, רק בצורה הנכונה RMCE במיקוד שיבוטים יכולים לעבד בזכות עמידות לתרופות אמרגן על הווקטור נכנס כי משחזר "לכודים" גני אמרגן-פחות התנגדות neomycin (ניאו R) הנוכחים בגנום R26 של תאי העגינה (איור 1) 10, 11. התוצאה היא יעילות מיקוד גבוהה מאוד, לעתים קרובות קרובה 100% 11, </ sup> 12. לסיכום, מיקוד מבוסס RMCE הוא יעיל ביותר וניתן להשתמש בו ללימודים-פונקציות מבנה; עם זאת, זה דורש מוקד הגנומי טרום מהונדס.

איור 1
איור 1. ייצוג סכמטי של מיקוד בתיווך RMCE. RMCE מאפשר החלפת מקטעי דנ"א מתוך וקטור מיקוד הנכנסת מוקד הגנומי מוגדר אם הן נמל שני אתרי FRT heterospecific (מתואר על ידי משולשים לבנים ואדומים). בנוסף, לוקוס גנומי מהונדסים מכיל promoterless ו-התנגדות neomycin קטועה גן (ניאו R). על ידי מתן מקדם ולהתחיל קודון של קטע DNA נכנס, רק אירועי רקומבינציה נכונים לשחזר התנגדות neomycin, וכתוצאה מכך יעיל מיקוד גבוה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של tהדמות שלו.

הנדסת הגנום ב mESCs מאפשרת לדור של עכברים תואמים RMCE. בשנת 1981, שתי הקבוצות הצליחו ללכוד תאים פלוריפוטנטיים ממסת התאים הפנימית (ICM) של blastocysts ובשמירה עליהם בתרבות 13, 14. mESCs מסוגל התחדשות עצמית והבחן לתוך כל סוגי תאים עובריים מבוגרים, כולל שושלת התא הניבט. לכן, גן מיקוד mESCs מאפשר לימודים הפוכים-גנטיים באמצעות הפיתוח של מכונן או מותנים (באמצעות מערכת Cre / LoxP) עכברי KO. עם זאת, הדרך הקלאסית לבודד תאי עכבר ES הוא מאוד לא יעיל. שיפורים מרכזיים הגדילו את שיעור ההצלחה מאוד עבור קווי המסקלין נובעים, כוללים השימוש בסרום-החלפה מוגדרת (SR) בינונית 15, לסירוגין בין מדיום המסקלין המכיל סרום שור SR ו עוברי (FBS) 16, ושימוש pharmacoתרכובות לוגיות כגון pluripotin או 2i 17. Pluripotin, מולקולה סינתטית קטנה, מאפשר התפשטות של mESCs במצב מובחן בהעדר גורם מעכבות לוקמיה (LIF) ו פיברובלסטים עובריים בעכבר (MEFs) 18. לבסוף, הוכח כי ניתן לבודד mESCs עם יעילות גבוהה מאוד (קרוב ל 100%), כאשר פרוטוקול ההתחלפות בינוני SR / FBS משולב עם LIF ו pluripotin 19, 20. פרוטוקולים אלה מאפשרים בידוד יעיל של mESCs RMCE תואם KO שיכולים לשמש בהמשך למחקרים מבנה-תפקוד.

מאמר זה מתאר שיטה המאפשרת אחד כדי לזהות את התחומים או שאריות המפתח בתוך חלבון כי הם אחראים על תהליכים תאיים ספציפיים. לשם כך, צנרת של טכנולוגיות מתקדמות המאפשרות בידוד המסקלין יעיל, הרכבת וקטור מיקוד, מיקוד המסקלין הייתה ליצורד. כמו לוחות כאלה, גדולים עם isoforms חלבון, מוטציות תחום ומפעילים במורד הזרם יכול להיות הציג mESCs KO וניתן להעריך את יכולתם להציל את הפנוטיפ KO חוץ גופית.

Protocol

כל הניסויים על עכברים נערכו בהתאם לתקנות בעלי חיים מוסדיות, לאומיות, ואירופאיות. 1. בידוד של mESCs KO RMCE תואם גזע בעכברים KO הטרוזיגוטיים עם עכברים RMCE תואמת, כגון ROSALUC עכברים 10 או ROSA26-iPS…

Representative Results

ההליך לבודד RMCE תואם קווי KO המסקלין מתואר באיור 2. שני דרגסטור רצופים נדרשים להשיג blastocysts KO-תואם RMCE. ראשית, עכברים KO הטרוזיגוטיים נחצים עם עכברים RMCE תואם להשיג תואם-RMCE, עכברים KO הטרוזיגוטיים. עכברים אלה משמשים לאחר מכן עבור הזדווגויות מתוזמן ע…

Discussion

שיטת הבידוד המסקלין שלנו הוא ידידותי למשתמש ואינו דורש מיומנויות מתקדמות או ציוד, כגון מיקרו-של blastocysts. לפיכך, הטכנולוגיה הזו נגישה חלק גדול מהקהילה המדעית. כל מי שיש לו ניסיון תרבית תאים בסיסי יכול להפיץ בצמחי ICM ולהקים קווי mESCs. עם זאת, שטיפה וטיפול של blastocysts דורש קצת ?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

אנו מודים Jinke D'Hont, פרדריק ואן Rockeghem, נטלי Farla, קלי Lemeire, ו Riet דה Rycke לקבלת תמיכה טכנית מעולה שלהם. אנו מודים גם Eef Parthoens, Evelien ואן Hamme, ואמנדה גונסאלביס ממתקן Core bioimaging של מרכז המחקר דלקת לסיוע המומחה שלהם. אנו מודים לחברי קבוצת המחקר שלנו לדיונים חשובים. עבודה זו נתמכה על ידי מדיניות המדע הבלגית (פולני אטרקציה הבינאוניברסיטאי Belspo – פרס IAP VII-07 DevRepair; https://devrepair.be), על ידי הקרן הרפואית המלכה אליזבת, בלגיה (GSKE 2008-2010; http: // www .fmre-gske.be), ועל ידי פעולות מחקר מתואמת (GOA 01G01908) של גנט האוניברסיטה, בלגיה (http://www.ugent.be/en/ghentuniv). SG הוא עמית פוסט של קרנות מחקר פלנדריה (FWO-V).

Materials

ROSALUC Mice made in house frozen sperm available upon request
R26-iPSC mice made in house frozen sperm available upon request
Vessel probe Fine Science Tools 10160-13 to check for copulation plugs
M2 medium Sigma-Aldrich M7167 make aliquots and store at -20°C
Fine forceps (Dumont #5 Standard tip Student forceps) Fine Science Tools 11251-10 spray with 70% EtOH before use (do not autoclave)
23G needles Fine-ject 8697
1-ml syringes Soft-ject 6680
60-mm bacterial grade plates (for flushing)  Gosselin BB60-01
Mouth pipette made in house see discussion
Mouse embryonic fibroblasts (MEFs, TgN (DR4)1 Jae strain) ATTC SCRC-1045
TgN (DR4)1 Jae mice The Jackson Laboratory 3208
Mitomycin C  Sigma-Aldrich M0503
Phosphate buffered saline (PBS) without calcium or magnesium Gibco 14190-094
Tg(DR4)1Jae/J mice JAX 3208 mice that contain four drug-selectable genes and DR4 MEFS confers resistance to neomycin, puromycin, hygromycin and 6-thioguanine
0.1% Gelatin Sigma-Aldrich G1393 Dissolve 0.5 g in 500 ml distilled water, autoclave and store at 4°C.
Trypsin (0.25%)  Gibco 25200-056
2 μM pluripotin Cayman Chemical 10009557
pRMCE-DV1 BCCM/LMBP collection  LMBP 08870 public available from the BCCM/LMBP collection (http://bccm.belspo.be) 
cre-excised pRMCE-DV1 BCCM/LMBP collection  LMBP 08195 public available from the BCCM/LMBP collection (http://bccm.belspo.be) 
pCAG-FlpE-IRES-Puro-pA  Addgene 20733
heat-shock competent DH5α bacteria  made in house
Gateway pDONR221 vector Thermo Fisher 12536-017 contains kanamycin-resistance gene
BP clonase II mix Thermo Fisher 11789-020
LR clonase II mix Thermo Fisher 11791-020 
Luria Broth (LB) 
Ampicillin 
Applied Biosystems 3730XL DNA Analyzer Thermo Fisher 3730XL
G418 Thermo Fisher 11811-023
Lipofectamine 2000 transfection reagent Thermo Fisher 11668027
Lipofectamine LTX transfection reagent Thermo Fisher 15338100
Effectene transfection reagent Qiagen 301425
GATEWAY pENTR 1A vector Thermo Fisher A10462 recombination-compatible vector
mouse monoclonal anti-p120ctn antibody BD Transduction Laboratories 610134
mouse monoclonal anti-Ecadherin antibody BD Transduction Laboratories 610181
General equipment:
Sterile dissection tools fine scissors and forceps for dissecting the uterus
Sterile pipettes: 5 ml, 10 ml and 25 ml
15-ml and 50-ml conical centrifuge tubes
96-well culture plates V-shaped bottom and flat bottom) 
Culture dishes: 24 wells, 12 wells and 6 wells
Multichannel pipettes (to pipette 30, 50, 100 and 200 μl) 
Sterile multichannel reservoirs
Access to a laminar air flow
Access to an incubator at 37°C with 5% CO2
Access to an inverted microscope
Access to a bench-top centrifuge
Access to a stereo microscope with transmitted-light 
Culture media:
MEF Medium: stored at 4°C; warm 30 min at 37°C before use
 Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) Gibco 41965-062
10% fetal bovine serum (FBS) Sigma-Aldrich F-7524
L-glutamine (2 mM) Gibco 25030-024 
Sodium pyruvate  (0.4 mM) Gibco 11360-039 
penicillin (100 U/ml) Gibco 15140-122 
streptomycin (100 µg/ml) Gibco 15140-122 
SR-based mESC medium: stored at 4°C; warm 30 min at 37°C before use
DMEM/F12 Gibco 31330-038 mixed in a 1:1 ratio
15% knock-out serum replacement (SR ) Gibco 10828–028
L-glutamine (2 mM) Gibco 25030-024 
0.1 mM non-essential amino acids  Gibco 11140-050
penicillin (100 U/ml) Gibco 15140-122 
streptomycin (100 µg/ml) Gibco 15140-122 
β-mercaptoethanol (0.1 mM)  Sigma-Aldrich M 3148 
2,000 U/ml recombinant mouse LIF  (IRC/VIB Protein Service facility)
FBS-based mESC medium (similar to SR-based mESC medium): stored at 4°C; warm 30 min at 37°C before use
Knockout DMEM Gibco 10829-018 
15% FBS Hyclone SH30070.03E
Differention Medium stored at 4°C; warm 30 min at 37°C before use
Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) Gibco 21980-032 
15% FBS Hyclone SH30070.03E
5% CD Hybridoma Medium(1x) liquid   Gibco 11279-023 
 2 mM L-glutamine Gibco 25030-024 
0.4 mM 1-thioglycerol Sigma-Aldrich M-6145
50 μg/ml ascorbic acid Sigma-Aldrich A-4544 
penicillin (100 U/ml) Gibco 15140-122 
streptomycin (100 µg/ml) Gibco 15140-122 
2i
1 μM Erk inhibitor PD0325901  Axon Medchem Axon 1408
3 μM Gsk3 inhibitor CHIR99021 Axon Medchem Axon 1386

References

  1. Gul, I. S., Hulpiau, P., Saeys, Y., van Roy, F. Metazoan evolution of the armadillo repeat superfamily. Cell Mol Life Sci. , (2016).
  2. Valenta, T., Hausmann, G., Basler, K. The many faces and functions of beta-catenin. EMBO J. 31, 2714-2736 (2012).
  3. Pieters, T., van Hengel, J., van Roy, F. Functions of p120ctn in development and disease. Front Biosci. 17, 760-783 (2012).
  4. Keirsebilck, A., et al. Molecular cloning of the human p120ctn catenin gene (CTNND1): Expression of multiple alternatively spliced isoforms. Genomics. 50, 129-146 (1998).
  5. Capecchi, M. R. Gene targeting in mice: functional analysis of the mammalian genome for the twenty-first century. Nat Rev Genet. 6, 507-512 (2005).
  6. Wang, H., et al. One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 153, 910-918 (2013).
  7. Yang, H., et al. One-step generation of mice carrying reporter and conditional alleles by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 154, 1370-1379 (2013).
  8. Fu, Y., et al. High-frequency off-target mutagenesis induced by CRISPR-Cas nucleases in human cells. Nat Biotechnol. 31, 822-826 (2013).
  9. Branda, C. S., Dymecki, S. M. Talking about a revolution: The impact of site-specific recombinases on genetic analyses in mice. Dev Cell. 6, 7-28 (2004).
  10. Sandhu, U., et al. Strict control of transgene expression in a mouse model for sensitive biological applications based on RMCE compatible ES cells. Nucleic Acids Res. 39, 1 (2010).
  11. Haenebalcke, L., et al. Efficient ROSA26-based conditional and/or inducible transgenesis using RMCE-compatible F1 hybrid mouse embryonic stem cells. Stem Cell Rev. 9, 774-785 (2013).
  12. Pieters, T., et al. p120 Catenin-Mediated Stabilization of E-Cadherin Is Essential for Primitive Endoderm Specification. PLoS Genet. 12, e1006243 (2016).
  13. Evans, M. J., Kaufman, M. H. Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos. Nature. 292, 154-156 (1981).
  14. Martin, G. R. Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryos cultured in medium conditioned by teratocarcinoma stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 78, 7634-7638 (1981).
  15. Cheng, J., Dutra, A., Takesono, A., Garrett-Beal, L., Schwartzberg, P. L. Improved generation of C57BL/6J mouse embryonic stem cells in a defined serum-free media. Genesis. 39, 100-104 (2004).
  16. Bryja, V., et al. An efficient method for the derivation of mouse embryonic stem cells. Stem Cells. 24, 844-849 (2006).
  17. Ying, Q. L., et al. The ground state of embryonic stem cell self-renewal. Nature. 453, 519-523 (2008).
  18. Chen, S., et al. Self-renewal of embryonic stem cells by a small molecule. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 17266-17271 (2006).
  19. Pieters, T., et al. Efficient and User-Friendly Pluripotin-based Derivation of Mouse Embryonic Stem Cells. Stem Cell Rev. 8, (2012).
  20. Yang, W., et al. Pluripotin combined with leukemia inhibitory factor greatly promotes the derivation of embryonic stem cell lines from refractory strains. Stem Cells. 27, 383-389 (2009).
  21. Haenebalcke, L., et al. The ROSA26-iPSC Mouse: A Conditional, Inducible, and Exchangeable Resource for Studying Cellular (De)Differentiation. Cell Rep. 3, (2013).
  22. Tucker, K. L., Wang, Y., Dausman, J., Jaenisch, R. A transgenic mouse strain expressing four drug-selectable marker genes. Nucleic Acids Res. 25, 3745-3746 (1997).
  23. Nyabi, O., et al. Efficient mouse transgenesis using Gateway-compatible ROSA26 locus targeting vectors and F1 hybrid ES cells. Nucleic Acids Res. 37, 55 (2009).
  24. Katzen, F. Gateway((R)) recombinational cloning: a biological operating system. Expert Opin Drug Discov. 2, 571-589 (2007).
  25. Schaft, J., Ashery-Padan, R., vander Hoeven, F., Gruss, P., Stewart, A. F. Efficient FLP recombination in mouse ES cells and oocytes. Genesis. 31, 6-10 (2001).
  26. Spencer, H. L., et al. E-cadherin inhibits cell surface localization of the pro-migratory 5T4 oncofetal antigen in mouse embryonic stem cells. Mol Biol Cell. 18, 2838-2851 (2007).
  27. Stryjewska, A., et al. Zeb2 Regulates Cell Fate at the Exit from Epiblast State in Mouse Embryonic Stem Cells. Stem Cells. , (2016).
  28. Nagy, A., Gertsenstein, M., Vintersten, K., Behringer, R. . Manipulating the mouse embryo: A laboratory manual. , (2003).
  29. van den Berghe, V., et al. Directed migration of cortical interneurons depends on the cell-autonomous action of Sip1. Neuron. 77, 70-82 (2013).
  30. Li, J., et al. The EMT transcription factor Zeb2 controls adult murine hematopoietic differentiation by regulating cytokine signaling. Blood. , (2016).

Play Video

Cite This Article
Pieters, T., Haenebalcke, L., Bruneel, K., Vandamme, N., Hochepied, T., van Hengel, J., Wirth, D., Berx, G., Haigh, J. J., van Roy, F., Goossens, S. Structure-function Studies in Mouse Embryonic Stem Cells Using Recombinase-mediated Cassette Exchange. J. Vis. Exp. (122), e55575, doi:10.3791/55575 (2017).

View Video