在小鼠胚胎干细胞结构功能研究使用重组酶介导的盒式交换

据估计，哺乳动物的基因组包含约20000个蛋白质编码基因。选择性剪接和翻译后修饰进一步增加蛋白质的剧目。蛋白具有模块化结构¹和通常包含多个相互作用结构域，其允许其招募不同的蛋白质复合物以及它们在多种细胞过程²的参与。一个例子是所谓的p120ctn各多功能蛋白。 p120ctn各由Ctnnd1基因编码，并且由通过N端和C端区域侧接的大型中央犰狳重复结构域。的p120ctn各犰狳域结合经典钙黏着蛋白，其参与细胞 – 细胞粘着的高度保守的近膜结构域，但它也结合所述转录阻遏Kaiso。 p120ctn各的N-末端结构域具有不同的激酶，磷酸酶，小RhoGTPases，和微管相关p相互作用roteins ^3。有趣的是，作为选择性剪接的结果，可以从四个备选起始密码子⁴产生同种型p120ctn各。亚型p120ctn各1A是最长的，因为它是从最-5' 翻译起始密码子，并含有全长N-末端片段。在同种型中p120ctn各3和4所示，该N端片段部分和完全，分别删除。了解蛋白质（或蛋白质亚型）和他们的域名在不同的细胞功能的确切作用仍然是一个挑战。

基因靶向mESCs使蛋白质功能的研究，通过相应基因的基因缺失和发育的重要疾病相关的基因和通路的识别已经广泛贡献。这一突破在反向遗传学在mESC的分离和基因靶向的领域的发展的结果，由于同源重组⁵ </s了>。同源重组是在其中的DNA片段的双链（DS）DNA断裂后两个相似或相同的核酸部分之间交换的过程。通常情况下，HR是低效的，因为双链DNA断裂是罕见的。最近，同源定向基因靶向的效率可以使用位点特异性核酸酶^6,7被增加，但不幸的是，这些都是容易脱靶效应^8。一个更可靠的技术，以使基因靶向是RMCE，这是基于位点特异性重组系统，如酶Cre / loxP位或FLPE / FRT。 loxP和FRT序列在噬菌体P1被发现和酿酒酵母 ，分别和由34个碱基对，包括确定该网站的取向的不对称8bp的序列。在另一方面，中，定向例如，DNA拉伸内的两个loxP位将决定两侧装接loxP DNA是否变得切除或I在的Cre介导的重组⁹ nversed。此外，Cre重组酶也可以诱导易位如果两个站点位于不同染色体上。 RMCE采用异种重组位不交叉反应和嵌入在一个基因位点的优势。在包含由相同的异种位点侧翼的DNA片段的供体质粒的存在，重组酶将插入该DNA片段成因为双同时易位（ 图1）的RMCE兼容基因组基因座。在这里，只有正确RMCE靶向克隆可以使药物抗性由于对传入向量的启动子，恢复了“俘获”无启动子的新霉素抗性基因（neo ^R）存在于所述对接单元的R26基因组（ 图1） ^10，11。这导致了非常高的靶向效率，通常接近^100％11，</ SUP> ^12。总之，基于RMCE靶向效率高，可用于结构 – 功能研究;但是，它需要一个预先设计的基因组位点。

图1. RMCE介导的靶向示意图。 RMCE允许DNA片段从进入靶向载体至限定基因组基因座的交换如果两个怀有2个异种FRT位点（由白色和红色三角形描绘）。此外，工程化基因组基因座包含一个启动子和截短的新霉素抗性（NEO ^R）基因。通过在进入的DNA片段提供启动子和起始密码子，只有正确的重组事件恢复新霉素抗性，从而导致高的定位效率。 请点击此处查看T的放大版他的身影。

在mESCs基因组工程允许RMCE兼容小鼠的产生。在1981年，两组成功地从胚泡的内细胞团（ICM）捕获多能细胞，并且在培养^{13 和 14}保持它们。 mESCs是能够自我更新和分化成所有类型的胚胎和成年细胞，包括生殖细胞谱系。因此，在基因靶向mESCs通过组成型或条件（使用酶Cre / loxP系统）KO小鼠的发展，使反向遗传学研究。然而，分离的小鼠ES细胞中的经典方法是非常低效的。几个重大的改进已大大增加成功率，用于导出mESC的线，包括使用限定的血清替代（SR）培养基中¹⁵的，含有SR和胎牛血清^（FBS）16 mESC的介质之间交替，并且使用药理的逻辑化合物如pluripotin或2I ^17。 Pluripotin，小合成分子，允许mESCs的未分化状态在不存在白血病抑制因子（LIF）和小鼠胚胎成纤维细胞（MEF中^）18传播。最后，已经显示，mESCs可以以非常高的效率（接近100％）时的SR / FBS培养基交替协议与LIF和pluripotin ^19,20组合来分离。这些协议使能随后用于结构 – 功能研究RMCE兼容KO mESCs的有效隔离。

本文描述了使一个以确定负责特定细胞过程的蛋白中的关键的结构域或残基的方法。为此，先进的技术，实现高效mESC的隔离，靶向载体组件和mESC的目标管道是创建天。与蛋白同种型，结构域突变体，和下游效应物，例如，大板可以在KO mESCs被引入并可以针对其营救体外 KO表型的能力进行评估。