Non-invasive<em> In Vivo</em> Fluorescência de imagem óptico de Inflamatória MMP Atividade Usando um Agente de Imaging Activatable fluorescente
Summary
Este documento explica a aplicação de imagem fluorescente usando uma sonda de imagiologia óptica activável para visualizar a actividade in vivo de metaloproteinases de matriz chave em dois modelos experimentais diferentes de inflamação.
Abstract
Este trabalho descreve um método não invasivo para a formação de imagens de metaloproteinases de matriz (MMP) por meio de uma sonda fluorescente ativável, através de imagens ópticas de fluorescência in vivo (OI), em dois modelos diferentes de inflamação: uma artrite reumatóide (RA) e um contato Reacção de hipersensibilidade (CHR). A luz com um comprimento de onda na janela do infravermelho próximo (NIR) (650 – 950 nm) permite uma penetração mais profunda do tecido e uma absorção de sinal mínima em comparação com comprimentos de onda inferiores a 650 nm. As principais vantagens da utilização de fluorescência OI é que é barato, rápido e fácil de implementar em diferentes modelos animais.
As sondas fluorescentes activáveis são opticamente silenciosas nos seus estados inactivados, mas tornam-se altamente fluorescentes quando activadas por uma protease. As MMPs activadas conduzem à destruição dos tecidos e desempenham um papel importante na progressão da doença em reacções de hipersensibilidade de tipo retardado (DTHRs) tais como RA e CHR. Além disso, as MMPs sãoas proteases essenciais para a cartilagem e osso e são degradação induzida por macrófagos, fibroblastos e condrócitos em resposta a citoquinas pró-inflamatórias. Aqui nós usar uma sonda que é activada pelas MMPs chave como a MMP-2, -3, -9 e -13 e descrever um protocolo de imagiologia para perto OI fluorescência no infravermelho de actividade de MMP na AR e ratinhos de controlo 6 dias após a indução da doença bem como em ratos com aguda (1x desafio) e crônica (5x desafio) CHR na orelha direita em comparação com os ouvidos saudáveis.
Introduction
doenças auto-imunes tais como artrite reumatóide (AR) ou psoríase vulgar são classificadas como reacções de hipersensibilidade do tipo retardado (DTHRs). 1 AR é uma doença auto-imune comum caracterizada por sinovite erosiva e destruição da articulação. 2 articulações artríticas inflamadas demonstrar a infiltração e a proliferação de células inflamatórias, um aumento da expressão de células pró-inflamatórias que conduzem à formação de pannus, cartilagem e osso destruições. 3, 4 A clivagem de moléculas da matriz extracelular, tal como colagio por metaloproteinases de matriz (MMPs), é essencial para a conversão de tecido e a angiogénese e provoca destruição de tecidos. 5, 6 de contato reacções de hipersensibilidade (CHR) são caracterizadas pela agregação de neutrófilos que conduzem a uma explosão oxidativa. 7 Semelhante ao RA, MMPs em CHR são involved na conversão de tecido, a migração celular e a angiogénese, a fim de estabelecer a inflamação crónica.
Para investigar a AR, foi usada a isomerase de glucose-6-fosfato (GPI) modelo de ratinho injecção -serum. 8 O soro de ratinhos K / BXN transgénicas contendo anticorpos contra a GPI, foi injectada em ratinhos Balb / c, após o que a inflamação reumática começaram a desenvolver dentro de 24 h com um máximo de tornozelo inchaço no dia 6 após a injecção GPI-soro (ver 1.1). Para analisar CHR crónica, ratinhos C57BL / 6 foram sensibilizados com trinitroclorobenzeno (TNCB) no abdómen. A orelha direita foi desafiada até 5 vezes a partir de 1 semana após a sensibilização (ver também 1,1 e 1,2).
Não invasiva pequena OI animal é uma técnica baseada na investigação in vivo de Fluorescente, chemiluminescent- e bioluminescentes-sinais, que são usados principalmente em estudos pré-clínicos. Os dados semi-quantitativa adquiriu dá insights sobre o MolecMecanismos moleculares nos órgãos e tecidos de modelos animais saudáveis e doentes, e permite medições de seguimento longitudinal ( por exemplo, para avaliar os perfis de resposta terapêutica in vivo ). Uma grande vantagem dos estudos longitudinais é a redução do número de animais, uma vez que os mesmos animais podem ser medidos em estudos de acompanhamento em vários pontos de tempo, em vez de usar ratos diferentes por ponto de tempo. A resolução de OI permite imagens funcionais detalhadas de órgãos e estruturas de tecido ainda menores em animais experimentais.
O uso de filtros específicos de excitação e emissão com um espectro de transmissão estreito, uma proteção contra a luz dispersa por uma "caixa escura" à prova de luz e uma câmera sensível de acoplamento de carga (CCD), que é resfriada em muitos dispositivos até -70 ° C , Permite medidas altamente específicas e sensíveis de sinais de fluorescência.
Utilizando agentes fluorescentes comEspectro de emissão na janela de fluorescência do infravermelho próximo (650 – 950 nm), as relações sinal / ruído podem ser melhoradas significativamente. A janela de fluorescência no infravermelho próximo é caracterizada por uma absorção relativamente baixa do sinal por hemoglobina e água, bem como uma auto-fluorescência de baixo fundo. 9 Isso permite uma profundidade de penetração de até 2 cm no tecido de pequenos animais. As sondas OI podem dirigir-se directamente a um alvo ( por exemplo, por um anticorpo marcado com fluoresc�cia) ou podem ser activadas no tecido alvo ( por exemplo, por proteases). As sondas OI activáveis são opticamente silenciosas na sua forma inactivada devido à transferência de energia de ressonância de Förster (FRET) para uma porção de extinção, que transfere a energia de excitação dentro da molécula para outro domínio. Se o corante é clivado (por uma protease, por exemplo) a energia não é mais transferida dentro da molécula e um sinal fluorescente pode ser detectado por OI. Isto permite a concepção de sondas OI com alta especificidadey para os processos biológicos distintos e excelentes Noise-relações sinal-para-.
O protocolo que se segue explica em pormenor a preparação dos animais, as medições OI OI utilizando uma sonda Activatable a imagem de MMP-2, -3, -9 e -13 actividade in vivo e dois modelos experimentais de inflamação (RA, CHR).
Protocol
Representative Results
Discussion
OI é uma ferramenta muito útil, rápida e barata para imagens moleculares in vivo não invasivas em pesquisas pré-clínicas. Uma força particular de OI é a capacidade de monitorar processos altamente dinâmicos como respostas inflamatórias. Além disso, OI permite que se siga o curso de uma doença por um período de tempo prolongado, variando de dias a semanas.
OI tem várias vantagens em relação a outras modalidades de imagem in vivo , tais como a tomografia por e…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a Daniel Bukala, Natalie Altmeyer e Funda Cay para excelente suporte técnico. Agradecemos Jonathan Cotton, Greg Bowden e Paul Soubiran para a edição do manuscrito. Este trabalho foi apoiado pela Werner Siemens-Foundation e da Faculdade de Medicina da Universidade Eberhard Karls de Tübingen ( '' Promotionskolleg '') e pela DFG através da CRC 156 (C3 projeto).
Materials
| Cornergel | Gerhard Mann GmbH | 1224635 | ophthalmic ointment |
| Forene | Abbott GmbH | 4831850 | isoflurane |
| U40 insulin syringe | Becton Dickinson and Company | 324876 | |
| Heparin | Sintetica | 6093089 | |
| High-Med-PE 0.28×0.61mm | Reichelt Chemietechnik GmbH+Co | 28460 | polyethylene tubing, inner diameter 0.28 mm, outer diameter 0.61 mm |
| BD Regular Bevel Needles, 30 G | Becton Dickinson & Co. Ltd. | 305106 | 30 G injection cannula |
| RTA-0011 isoflurane vaporizer | Vetland Medical Sales and Services LLC | – | |
| Artagain drawing paper | Strathmore Artist Paper | 446-8 | coal black |
| IVIS Spectrum | Perkin Elmer | 124262 | Optical imaging system |
| BD Regular Bevel Needles, 25 G | Becton Dickinson and Company | 305122 | |
| 2-Chloro-1,3,5-trinitrobenzene | Sigma Aldrich GmbH | 7987456F | TNCB |
| MMPSense 680 | Perkin Elmer | NEV10126 | fluorescent imaging dye |
| Oditest | Koreplin GmbH | C1X018 | mechanical measurment |
| Miglyol 812 | SASOL | – | Oil |
| BALB/C, C57BL/6 | Charles River Laboratories | – | Mice used for experiements |
| PBS | Sigma Aldrich GmbH | For dilution of the RA serum | |
| Pipette (100µl) | Eppendorf | Used for TNCB application | |
| shaver | Wahl | 9962 | Animal hair trimmer |
| Living Image | Perkin Elmer | Imaging software to measure OI |
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