Non invasivo<em> In Vivo</em> Fluorescenza ottica di imaging dell'attività MMP infiammatoria utilizzando un agente fluorescente di imaging attivo
Summary
Questo articolo spiega l'applicazione dell'immagine fluorescente utilizzando una sonda ottica attivabile per la visualizzazione dell'attività in vivo delle metalloproteinasi di matrici chiave in due diversi modelli sperimentali di infiammazione.
Abstract
In questo articolo si descrive un metodo non invasivo per l'attività di matrice metalloproteinasi (MMP) di imaging mediante una sonda fluorescente attiva, tramite l' ottica ottica (OI) in fluorescenza in vivo , in due diversi modelli di infiammazione: un artrite reumatoide (RA) e un contatto Modello di reazione di ipersensibilità (CHR). La luce con una lunghezza d'onda nella finestra vicino a infrarossi (NIR) (650 – 950 nm) consente una penetrazione più profonda del tessuto e un assorbimento minimo del segnale rispetto alle lunghezze d'onda inferiori a 650 nm. I principali vantaggi che usano l'OI di fluorescenza è che è conveniente, veloce e facile da implementare in diversi modelli animali.
Le sonde fluorescenti attivatabili sono otticamente silenziose nei loro stati inattivati, ma diventano altamente fluorescenti quando attivata da una proteasi. I MMP attivati portano alla distruzione dei tessuti e svolgono un ruolo importante per la progressione della malattia nelle reazioni di ipersensibilità di tipo ritardato (DTHR) come RA e CHR. Inoltre, i MMP sonoLe proteasi chiave per la cartilagine e il degrado dell'osso e sono indotti da macrofagi, fibroblasti e condrociti in risposta a citochine pro-infiammatorie. Qui usiamo una sonda che viene attivata dai MMP chiave come MMP-2, -3, -9 e -13 e descrivono un protocollo di imaging per l'attività di fluorescenza vicino all'infrarosso OI dell'attività MMP in RA e nei topi di controllo 6 giorni dopo l'induzione della malattia Come nei topi con l'acuto (1x challenge) e la cronica (5x challenge) CHR sull'orecchio destro rispetto alle orecchie sane.
Introduction
Le malattie autoimmuni come l'artrite reumatoide (RA) o la psoriasi vulgaris sono classificate come reazioni di ipersensibilità di tipo ritardato (DTHR). 1 RA è una malattia autoimmune comune caratterizzata da sinovite erosiva e distruzione congiunta. 2 Le articolazioni artrite infiammate dimostrano l'infiltrazione e la proliferazione delle cellule infiammatorie, una maggiore espressione di cellule pro-infiammatorie che portano alla formazione di pannus, alla cartilagine e alle distruzioni dell'osso. 3 , 4 La scissione di molecole di matrice extracellulare, come il collagene mediante matrici metalloproteinasi (MMPs), è essenziale per la conversione e l'angiogenesi dei tessuti e provoca distruzioni del tessuto. 5 , 6 Le reazioni di ipersensibilità di contatto (CHR) sono caratterizzate dall'aggregazione di neutrofili che portano ad uno scoppio ossidativo. 7 Simili a RA, i MMP in CHR sono involved nella conversione dei tessuti, la migrazione cellulare e l'angiogenesi per stabilire infiammazione cronica.
Per studiare RA, il glucosio-6-fosfato isomerasi (GPI) iniezione -serum modello di topo è stato utilizzato. 8 siero di topi K / BXN transgeniche contenenti anticorpi contro GPI, è stato iniettato in topi BALB / c naive dopodiché infiammazione reumatica cominciato a svilupparsi entro 24 h con un massimo di edemi declivi il giorno 6 dopo l'iniezione GPI-siero (vedi 1.1). Per analizzare CHR cronica, topi C57BL / 6 sono stati sensibilizzati con trinitrochlorobenzene (TNCB) sull'addome. L'orecchio destro è stato sfidato fino a 5 volte a partire 1 settimana dopo la sensibilizzazione (vedi anche 1.1 e 1.2).
Non invasiva piccoli animali OI è una tecnica basata sulle indagini in vivo del fluorescente-, chemiluminescent- e bioluminescenti-segnali, che vengono utilizzati principalmente nella ricerca preclinica. I dati semiquantitativa acquisita dà intuizioni nel MolecMeccanismi Ular negli organi e tessuti sani e modelli animali sperimentali malati, e consente longitudinale follow up misure (ad esempio per valutare profili di risposta terapeutica in vivo). Un grande vantaggio di studi longitudinali è la riduzione del numero di animali, come gli stessi animali possono essere misurati in studi di follow up in diversi punti temporali invece di utilizzare mouse diversi per punto temporale. La risoluzione di OI permette imaging funzionale dettagliata di organi e strutture tissutali più piccole in animali da esperimento.
L'uso di specifici filtri eccitazione e di emissione con uno spettro di trasmissione ristretta, una protezione contro luce diffusa da una tenuta di luce "scatola scura" ed un dispositivo charged-coupled sensibili (CCD), che viene raffreddata in molti dispositivi fino a -70 ° C , permette altamente specifico e misurazioni sensibili dei segnali di fluorescenza.
Utilizzando agenti fluorescenti con excitation- eGli spettri di emissione nella finestra di fluorescenza ad infrarossi vicino (650 – 950 nm), i rapporti segnale-rumore possono essere migliorati significativamente. La finestra a fluorescenza a infrarossi vicino è caratterizzata da un assorbimento relativamente basso del segnale da parte dell'emoglobina e dell'acqua così come una bassa fluorescenza di fondo. 9 Questo permette una profondità di penetrazione fino a 2 cm nel tessuto dei piccoli animali. Le sonde OI possono indirizzare direttamente un bersaglio ( ad esempio mediante un anticorpo a fluorescenza) oppure possono essere attivate nel tessuto bersaglio (per es. Mediante proteasi). Le sonde OI attuabili sono otticamente silenziose nella loro forma inattivata a causa del trasferimento di energia di risonanza di Förster (FRET) ad una parte di quenching, che trasferisce l'energia di eccitazione all'interno della molecola ad un altro dominio. Se il colorante viene ceduto (ad esempio da una proteasi), l'energia non è più trasferita all'interno della molecola e un segnale fluorescente può essere rilevato da OI. Ciò consente la progettazione di sonde OI ad alta specificitày per processi biologici distinti ed eccellenti segnale-rumore-ratio.
Il protocollo che segue illustra in dettaglio la preparazione degli animali, le misurazioni OI utilizzando una sonda OI Activatable all'immagine MMP-2, -3, -9 e -13 attività in vivo e due modelli sperimentali di infiammazione (RA, CHR).
Protocol
Representative Results
Discussion
OI è uno strumento molto utile, veloce e poco costoso per l'imaging molecolare non invasivo in vivo nella ricerca preclinica. Una particolare forza di OI è la capacità di monitorare processi altamente dinamici come risposte infiammatorie. Inoltre, l'OI permette di seguire il corso di una malattia per un lungo periodo di tempo, che va dai giorni alla settimana.
L'OI ha diversi vantaggi rispetto ad altre modalità di imaging in vivo , come la tomografi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo Daniel Bukala, Natalie Altmeyer e Funda Cay per un ottimo supporto tecnico. Ringraziamo Jonathan Cotton, Greg Bowden e Paul Soubiran per aver redatto il manoscritto. Questo lavoro è stato sostenuto dalla Fondazione Werner Siemens e dalla Facoltà di Medicina dell'Università Eberhard Karls Tübingen ('' Promotionskolleg '') e dal DFG attraverso la CRC 156 (progetto C3).
Materials
| Cornergel | Gerhard Mann GmbH | 1224635 | ophthalmic ointment |
| Forene | Abbott GmbH | 4831850 | isoflurane |
| U40 insulin syringe | Becton Dickinson and Company | 324876 | |
| Heparin | Sintetica | 6093089 | |
| High-Med-PE 0.28×0.61mm | Reichelt Chemietechnik GmbH+Co | 28460 | polyethylene tubing, inner diameter 0.28 mm, outer diameter 0.61 mm |
| BD Regular Bevel Needles, 30 G | Becton Dickinson & Co. Ltd. | 305106 | 30 G injection cannula |
| RTA-0011 isoflurane vaporizer | Vetland Medical Sales and Services LLC | – | |
| Artagain drawing paper | Strathmore Artist Paper | 446-8 | coal black |
| IVIS Spectrum | Perkin Elmer | 124262 | Optical imaging system |
| BD Regular Bevel Needles, 25 G | Becton Dickinson and Company | 305122 | |
| 2-Chloro-1,3,5-trinitrobenzene | Sigma Aldrich GmbH | 7987456F | TNCB |
| MMPSense 680 | Perkin Elmer | NEV10126 | fluorescent imaging dye |
| Oditest | Koreplin GmbH | C1X018 | mechanical measurment |
| Miglyol 812 | SASOL | – | Oil |
| BALB/C, C57BL/6 | Charles River Laboratories | – | Mice used for experiements |
| PBS | Sigma Aldrich GmbH | For dilution of the RA serum | |
| Pipette (100µl) | Eppendorf | Used for TNCB application | |
| shaver | Wahl | 9962 | Animal hair trimmer |
| Living Image | Perkin Elmer | Imaging software to measure OI |
References
- Veale, D. J., Ritchlin, C., FitzGerald, O. Immunopathology of psoriasis and psoriatic arthritis. Ann Rheum Dis. 64, 26 (2005).
- Harris, E. D. Rheumatoid arthritis. Pathophysiology and implications for therapy. N Engl J Med. 322 (18), 1277-1289 (1990).
- Lee, D. M., Weinblatt, M. E. Rheumatoid arthritis. Lancet. 358 (9285), 903-911 (2001).
- Firestein, G. S. Immunologic mechanisms in the pathogenesis of rheumatoid arthritis. J Clin Rheumatol. 11, S39-S44 (2005).
- Pap, T., et al. Differential expression pattern of membrane-type matrix metalloproteinases in rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum. 43 (6), 1226-1232 (2000).
- Firestein, G. S., Paine, M. M. Stromelysin and tissue inhibitor of metalloproteinases gene expression in rheumatoid arthritis synovium. Am J Pathol. 140 (6), 1309-1314 (1992).
- Schwenck, J., et al. In vivo optical imaging of matrix metalloproteinase activity detects acute and chronic contact hypersensitivity reactions and enables monitoring of the antiinflammatory effects of N-acetylcysteine. Mol Imaging. 13, (2014).
- Monach, P. A., Mathis, D., Benoist, C. The K/BxN arthritis model. Curr Protoc Immunol. 15, 22 (2008).
- Zelmer, A., Ward, T. H. Noninvasive fluorescence imaging of small animals. J Microsc. 252 (1), 8-15 (2013).
- Kouskoff, V., et al. Organ-specific disease provoked by systemic autoimmunity. Cell. 87 (5), 811-822 (1996).
- Fuchs, K., et al. In vivo imaging of cell proliferation enables the detection of the extent of experimental rheumatoid arthritis by 3′-deoxy-3′-18f-fluorothymidine and small-animal PET. J Nucl Med. 54 (1), 151-158 (2013).
- Schwenck, J., et al. Fluorescence and Cerenkov luminescence imaging. Applications in small animal research. Nuklearmedizin. 55 (2), 63-70 (2016).
- Mahling, M., et al. A Comparative pO2 Probe and [18F]-Fluoro-Azomycinarabino-Furanoside ([18F]FAZA) PET Study Reveals Anesthesia-Induced Impairment of Oxygenation and Perfusion in Tumor and Muscle. PLoS One. 10 (4), 0124665 (2015).
- Fuchs, K., et al. Oxygen breathing affects 3′-deoxy-3′-18F-fluorothymidine uptake in mouse models of arthritis and cancer. J Nucl Med. 53 (5), 823-830 (2012).
- Fuchs, K., et al. Impact of anesthetics on 3′-[18F]fluoro-3′-deoxythymidine ([18F]FLT) uptake in animal models of cancer and inflammation. Mol Imaging. 12 (5), 277-287 (2013).
- Liu, N., Shang, J., Tian, F., Nishi, H., Abe, K. In vivo optical imaging for evaluating the efficacy of edaravone after transient cerebral ischemia in mice. Brain Res. 1397, 66-75 (2011).
- Sheth, R. A., Maricevich, M., Mahmood, U. In vivo optical molecular imaging of matrix metalloproteinase activity in abdominal aortic aneurysms correlates with treatment effects on growth rate. Atherosclerosis. 212 (1), 181-187 (2010).
- Chen, J., et al. Near-infrared fluorescent imaging of matrix metalloproteinase activity after myocardial infarction. Circulation. 111 (14), 1800-1805 (2005).
- Wallis de Vries, B. M., et al. Images in cardiovascular medicine. Multispectral near-infrared fluorescence molecular imaging of matrix metalloproteinases in a human carotid plaque using a matrix-degrading metalloproteinase-sensitive activatable fluorescent probe. Circulation. 119 (20), e534-e536 (2009).
- Weissleder, R., Tung, C. H., Mahmood, U., Bogdanov, A. In vivo imaging of tumors with protease-activated near-infrared fluorescent probes. Nat Biotechnol. 17 (4), 375-378 (1999).
- Cortez-Retamozo, V., et al. Real-time assessment of inflammation and treatment response in a mouse model of allergic airway inflammation. J Clin Invest. 118 (12), 4058-4066 (2008).
- McIntyre, J. O., et al. Development of a novel fluorogenic proteolytic beacon for in vivo detection and imaging of tumour-associated matrix metalloproteinase-7 activity. Biochem J. 377, 617-628 (2004).
- Scherer, R. L., VanSaun, M. N., McIntyre, J. O., Matrisian, L. M. Optical imaging of matrix metalloproteinase-7 activity in vivo using a proteolytic nanobeacon). Mol Imaging. 7 (3), 118-131 (2008).
- Olson, E. S., et al. In vivo characterization of activatable cell penetrating peptides for targeting protease activity in cancer. Integr Biol (Camb. 1 (5-6), 382-393 (2009).
- Duijnhoven, S. M., Robillard, M. S., Nicolay, K., Grull, H. Tumor targeting of MMP-2/9 activatable cell-penetrating imaging probes is caused by tumor-independent activation). J Nucl Med. 52 (2), 279-286 (2011).
- Schafers, M., Schober, O., Hermann, S. Matrix-metalloproteinases as imaging targets for inflammatory activity in atherosclerotic plaques. J Nucl Med. 51 (5), 663-666 (2010).
- Wagner, S., et al. A new 18F-labelled derivative of the MMP inhibitor CGS 27023A for PET: radiosynthesis and initial small-animal PET studies. Appl Radiat Isot. 67 (4), 606-610 (2009).
- Waschkau, B., Faust, A., Schafers, M., Bremer, C. Performance of a new fluorescence-labeled MMP inhibitor to image tumor MMP activity in vivo in comparison to an MMP-activatable probe. Contrast Media Mol Imaging. 8 (1), 1-11 (2013).
- Vogl, T., et al. Alarmin S100A8/S100A9 as a biomarker for molecular imaging of local inflammatory activity. Nat Commun. 5, 4593 (2014).
