גנטי בקידוד היסטון-miniSOG גורם מוטציות תורשתי הגנום כולו באופן אור תלוי כחול. שיטת mutagenesis זה היא פשוטה, מהירה, ללא כימיקלים רעילים, מתאים היטב סריקה גנטית קדימה ואינטגרציה transgene.
Forward genetic screening in model organisms is the workhorse to discover functionally important genes and pathways in many biological processes. In most mutagenesis-based screens, researchers have relied on the use of toxic chemicals, carcinogens, or irradiation, which requires designated equipment, safety setup, and/or disposal of hazardous materials. We have developed a simple approach to induce heritable mutations in C. elegans using germline-expressed histone-miniSOG, a light-inducible potent generator of reactive oxygen species. This mutagenesis method is free of toxic chemicals and requires minimal laboratory safety and waste management. The induced DNA modifications include single-nucleotide changes and small deletions, and complement those caused by classical chemical mutagenesis. This methodology can also be used to induce integration of extrachromosomal transgenes. Here, we provide the details of the LED setup and protocols for standard mutagenesis and transgene integration.
מסך גנטי קדימה כבר בשימוש נרחב כדי ליצור מוטציות גנטיות לשבש תהליכים ביולוגיים שונים באורגניזמים מודל כגון elegans Caenorhabditis (ג elegans) 1. ניתוח של מוטציות כאלה להוביל לגילוי של גנים חשובים מבחינה תפקודית והאיתות שלהם מסלולי 1,2. באופן מסורתי, mutagenesis ב C. elegans מושגת באמצעות כימיקלים מוטגנים, קרינה, או transposons 2. כימיקלים כגון methanesulfonate אתיל (EMS) ו- N -ethyl- -nitrosourea N (ENU) הם רעילים לבני אדם; קרני גאמא או אולטרה סגול (UV) mutagenesis קרינה דורש ציוד מיוחד; זני transposon-פעיל, כגון זנים המוטטורי 3, יכולים לגרום מוטציות מיותרות במהלך תחזוקה. פיתחנו גישה פשוטה לגרום מוטציות תורשתיות באמצעות פוטוסנסיטייזר גנטית בקידוד 4.
(Reactive oxygen species ROS) יכול לגרום נזק לדנ"א 5.מחולל חמצן גופיה מיני (miniSOG) הוא חלבון פלואורסצנטי ירוק של 106 חומצות אמינו כי תוכננה מן LOV (אור, חמצן, ואת מתח) תחום של ארבידופסיס phototropin 2 6. בחשיפה לאור כחול (~ 450 ננומטר), miniSOG מייצר חמצן גופיית ROS כולל עם fl יבין mononucleotide בתור פקטור 6-8, אשר שוהה בכל התאים. בנינו חלבון היתוך-mSOG שלו על ידי תיוג miniSOG אל C- הסופי של היסטון-72, ג elegans וריאנט של היסטון 3. אנחנו שנוצר transgene חד עותק 9 להביע-mSOG שלו ב germline של ג elegans. בתנאי תרבות נורמלים בחושך, התולעים המהונדסים-mSOG שלו יש גודל גוזלים נורמלי תוחלת חי 4. בחשיפה לאור LED כחול, התולעים שלו-mSOG לייצר מוטציות תורשתיות בקרב הצאצאים שלהם 4. הספקטרום של מוטציות מושרות כולל שינויי נוקלאוטיד, כגון G: C ל- T: A ו- G: C ל- C: G ו- chromoso הקטןלי מחיקות 4. הליך mutagenesis זה הוא פשוט לביצוע, ודורש התקנת בטיחות במעבדה מינימאלית. כאן, אנו מתארים את התקנת תאורת LED ונהלי mutagenesis optogenetic.
כאן אנו מתארים הליך מפורט של mutagenesis optogenetic באמצעות שלו-mSOG לידי ביטוי germline ולספק דוגמה של מסך גנטי קדימה בקנה מידה קטן. לעומת mutagenesis כימי סטנדרטי, שיטת mutagenesis optogenetic זה יש מספר יתרונות. ראשית, זה לא רעיל, ובכך שמירה על אנשי המעבדה הרחק מוטאגנים כימיים רעילים כגון EMS, ENU ו trime…
The authors have nothing to disclose.
The work is supported by HHMI. We thank our lab members for their help with testing the protocol and revising the manuscript.
Ultra High Power LED light source | Prizmatix | UHP-mic-LED-460 | 460 ± 5 nm |
LED controller | Prizmatix | UHPLCC-01 | |
Digital function generator/amplifier | PASCO | PI-9587C | PI-9587C is no longer available. The replacement is PI-8127. |
BNC cable male/male | THORLABS | CA3136 | |
USB-TTL interface | Prizmatix | Optional | |
Photometer | THORLABS | PM50 and Model D10MM | |
Filter paper | Whatman | 1001-110 | |
Copper chloride dihydrate (CuCl2∙2H2O) | Sigma | C6641 | |
Stereomicroscope | Leica | MZ95 | |
NGM plate | Dissolve 5g NaCl, 2.5g Peptone, 20g Agar, 10 µg/ml cholesterol in 1 L H2O. After autoclaving, add 1 mM CaCl2, 1 mM MgSO4, 25 mM KH2PO4(pH6.0). | ||
Lysis solution | 10 mM Tris(pH8.8), 50 mM KCl, 0.1% Triton X100, 2.5 mM MgCl2, 100 µg/ml Proteinase K |