علم البصريات الوراثي الطفرات عشوائية عن طريق هيستون-miniSOG في<em> C. ايليجانس</em
Summary
المشفرة وراثيا هيستون-miniSOG يدفع الطفرات الوراثية الجينوم على نطاق بطريقة تعتمد الخفيفة والأزرق. هذه الطريقة الطفرات بسيطة وسريعة وخالية من المواد الكيميائية السامة، ومناسبة تماما للفحص الجيني إلى الأمام والتكامل التحوير.
Abstract
Forward genetic screening in model organisms is the workhorse to discover functionally important genes and pathways in many biological processes. In most mutagenesis-based screens, researchers have relied on the use of toxic chemicals, carcinogens, or irradiation, which requires designated equipment, safety setup, and/or disposal of hazardous materials. We have developed a simple approach to induce heritable mutations in C. elegans using germline-expressed histone-miniSOG, a light-inducible potent generator of reactive oxygen species. This mutagenesis method is free of toxic chemicals and requires minimal laboratory safety and waste management. The induced DNA modifications include single-nucleotide changes and small deletions, and complement those caused by classical chemical mutagenesis. This methodology can also be used to induce integration of extrachromosomal transgenes. Here, we provide the details of the LED setup and protocols for standard mutagenesis and transgene integration.
Introduction
وقد استخدمت على نطاق واسع شاشات الوراثية إلى الأمام لتوليد طفرات الوراثية تعطيل العمليات البيولوجية المختلفة في الكائنات نموذج مثل ايليجانس انواع معينة (C. ايليجانس) 1. التحاليل التي أجريت على تلك المسوخ تؤدي إلى اكتشاف الجينات مهمة وظيفيا ويشير على مسارات 1،2. تقليديا، الطفرات في C. ويتحقق ايليجانس استخدام المواد الكيميائية تسبب الطفرات الوراثية، الإشعاع، أو الترانسبوزونات 2. المواد الكيميائية مثل methanesulfonate الإيثيلي (EMS) وN -ethyl- N -nitrosourea (ENU) تكون سامة للبشر؛ أشعة جاما أو الأشعة فوق البنفسجية (UV) الطفرات الإشعاع يتطلب معدات خاصة. وسلالات ينقول النشط، مثل سلالات mutator 3، يمكن أن تسبب الطفرات غير الضرورية أثناء الصيانة. لقد قمنا بتطوير مقاربة بسيطة للحث على الطفرات الوراثية باستخدام الضيائي المشفرة وراثيا-4.
يمكن أن أنواع الاكسجين التفاعلية (ROS) الحمض النووي من التلف 5.مولد صغير القميص الأوكسجين (miniSOG) هو بروتين الفلورية الخضراء من 106 الأحماض الأمينية التي تم تصميمها من قائمة القيم (الضوء، والأكسجين، والجهد) مجال نبات الأرابيدوبسيس phototropin 2 6. عند التعرض للضوء الأزرق (~ 450 نانومتر)، miniSOG يولد ROS بما في ذلك الأكسجين القميص مع فلوريدا AVIN النوكليوتيد بمثابة العامل المساعد 6-8، التي هي موجودة في جميع الخلايا. بنينا بروتين الانصهار صاحب-mSOG عن طريق وضع علامات miniSOG إلى C-محطة من هيستون-72، وجيم ايليجانس البديل من هيستون 3. نحن إنشاء واحدة في نسخة التحوير 9 في التعبير عن رأيه، mSOG في سلالة الجرثومية من C. ايليجانس تحت ظروف التربية العادية في الظلام، والديدان المعدلة وراثيا صاحب-mSOG لها حجم الحضنة العادي والعمر الافتراضي 4. عند التعرض إلى الضوء الأزرق LED، الديدان صاحب-mSOG تنتج الطفرات الوراثية بين ذريتها 4. الطيف من الطفرات المستحثة يتضمن تغييرات النوكليوتيدات، مثل G: C إلى T: A و G: C إلى C: G، وchromoso صغيرةلي الحذف 4. هذا الإجراء الطفرات بسيط على القيام بها، ويتطلب الحد الأدنى من الإعداد سلامة المختبر. هنا، نحن تصف الإعداد إضاءة LED وإجراءات الطفرات علم البصريات الوراثي.
Protocol
Representative Results
Discussion
هنا، نحن تصف إجراءات تفصيلية من الطفرات علم البصريات الوراثي باستخدام اعرب-mSOG في سلالة الجرثومية وتقديم مثال على شاشة الوراثية إلى الأمام على نطاق صغير. بالمقارنة مع الطفرات الكيميائية القياسية، وهذه الطريقة الطفرات علم البصريات الوراثي لديها العديد من المزايا. أو…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The work is supported by HHMI. We thank our lab members for their help with testing the protocol and revising the manuscript.
Materials
| Ultra High Power LED light source | Prizmatix | UHP-mic-LED-460 | 460 ± 5 nm |
| LED controller | Prizmatix | UHPLCC-01 | |
| Digital function generator/amplifier | PASCO | PI-9587C | PI-9587C is no longer available. The replacement is PI-8127. |
| BNC cable male/male | THORLABS | CA3136 | |
| USB-TTL interface | Prizmatix | Optional | |
| Photometer | THORLABS | PM50 and Model D10MM | |
| Filter paper | Whatman | 1001-110 | |
| Copper chloride dihydrate (CuCl2∙2H2O) | Sigma | C6641 | |
| Stereomicroscope | Leica | MZ95 | |
| NGM plate | Dissolve 5g NaCl, 2.5g Peptone, 20g Agar, 10 µg/ml cholesterol in 1 L H2O. After autoclaving, add 1 mM CaCl2, 1 mM MgSO4, 25 mM KH2PO4(pH6.0). | ||
| Lysis solution | 10 mM Tris(pH8.8), 50 mM KCl, 0.1% Triton X100, 2.5 mM MgCl2, 100 µg/ml Proteinase K |
References
- Jorgensen, E. M., Mango, S. E. The art and design of genetic screens: caenorhabditis elegans. Nat Rev Genet. 3 (5), 356-369 (2002).
- Kutscher, L. M., Shaham, S. Forward and reverse mutagenesis in C. elegans. WormBook. , 1-26 (2014).
- Collins, J., Saari, B., Anderson, P. Activation of a transposable element in the germ line but not the soma of Caenorhabditis elegans. Nature. 328 (6132), 726-728 (1987).
- Noma, K., Jin, Y. Optogenetic mutagenesis in Caenorhabditis elegans. Nat Commun. 6, 8868 (2015).
- Cooke, M. S., Evans, M. D., Dizdaroglu, M., Lunec, J. Oxidative DNA damage: mechanisms, mutation, and disease. FASEB J. 17 (10), 1195-1214 (2003).
- Shu, X., et al. A genetically encoded tag for correlated light and electron microscopy of intact cells, tissues, and organisms. PLoS Biol. 9 (4), 1001041 (2011).
- Ruiz-Gonzalez, R., et al. Singlet oxygen generation by the genetically encoded tag miniSOG. J Am Chem Soc. 135 (26), 9564-9567 (2013).
- Pimenta, F. M., Jensen, R. L., Breitenbach, T., Etzerodt, M., Ogilby, P. R. Oxygen-dependent photochemistry and photophysics of “miniSOG,” a protein-encased flavin. Photochem Photobiol. 89 (5), 1116-1126 (2013).
- Frokjaer-Jensen, C., et al. Random and targeted transgene insertion in Caenorhabditis elegans using a modified Mos1 transposon. Nat Methods. 11 (5), 529-534 (2014).
- Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. 유전학. 77 (1), 71-94 (1974).
- Chaudhuri, J., Parihar, M., Pires-daSilva, A. An introduction to worm lab: from culturing worms to mutagenesis. J Vis Exp. (47), (2011).
- Berkowitz, L. A., Knight, A. L., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. Generation of stable transgenic C. elegans using microinjection. J Vis Exp. (18), (2008).
- Mello, C., Fire, A. DNA transformation. Methods Cell Biol. 48, 451-482 (1995).
- Fay, D., Bender, A. Genetic mapping and manipulation: chapter 4–SNPs: introduction and two-point mapping. WormBook. , 1-7 (2006).
- Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. J Vis Exp. (62), (2012).
- Westberg, M., Holmegaard, L., Pimenta, F. M., Etzerodt, M., Ogilby, P. R. Rational design of an efficient, genetically encodable, protein-encased singlet oxygen photosensitizer. J Am Chem Soc. 137 (4), 1632-1642 (2015).
- Xu, S., Chisholm, A. D. Highly efficient optogenetic cell ablation in C. elegans using membrane-targeted miniSOG. Sci Rep. 6, 21271 (2016).
- Mariol, M. C., Walter, L., Bellemin, S., Gieseler, K. A rapid protocol for integrating extrachromosomal arrays with high transmission rate into the C. elegans genome. J Vis Exp. (82), (2013).
- Lin, J. Y., et al. Optogenetic inhibition of synaptic release with chromophore-assisted light inactivation (CALI). Neuron. 79 (2), 241-253 (2013).
- Minevich, G., Park, D. S., Blankenberg, D., Poole, R. J., Hobert, O. CloudMap: A Cloud-Based Pipeline for Analysis of Mutant Genome Sequences. 유전학. 192 (>4), 1249-1269 (2012).
- Qi, Y., Xu, S. MiniSOG-mediated Photoablation in Caenorhabdtis elegans. Bio-protocol. 3 (1), 316 (2013).
- Qi, Y. B., Garren, E. J., Shu, X., Tsien, R. Y., Jin, Y. Photo-inducible cell ablation in Caenorhabditis elegans using the genetically encoded singlet oxygen generating protein miniSOG. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (19), 7499-7504 (2012).
- Nagel, G., et al. Light activation of channelrhodopsin-2 in excitable cells of Caenorhabditis elegans triggers rapid behavioral responses. Curr Biol. 15 (24), 2279-2284 (2005).
