Optogenetic mutagenesis אקראי באמצעות היסטון-miniSOG ב<em> C. elegans</em
Summary
גנטי בקידוד היסטון-miniSOG גורם מוטציות תורשתי הגנום כולו באופן אור תלוי כחול. שיטת mutagenesis זה היא פשוטה, מהירה, ללא כימיקלים רעילים, מתאים היטב סריקה גנטית קדימה ואינטגרציה transgene.
Abstract
Forward genetic screening in model organisms is the workhorse to discover functionally important genes and pathways in many biological processes. In most mutagenesis-based screens, researchers have relied on the use of toxic chemicals, carcinogens, or irradiation, which requires designated equipment, safety setup, and/or disposal of hazardous materials. We have developed a simple approach to induce heritable mutations in C. elegans using germline-expressed histone-miniSOG, a light-inducible potent generator of reactive oxygen species. This mutagenesis method is free of toxic chemicals and requires minimal laboratory safety and waste management. The induced DNA modifications include single-nucleotide changes and small deletions, and complement those caused by classical chemical mutagenesis. This methodology can also be used to induce integration of extrachromosomal transgenes. Here, we provide the details of the LED setup and protocols for standard mutagenesis and transgene integration.
Introduction
מסך גנטי קדימה כבר בשימוש נרחב כדי ליצור מוטציות גנטיות לשבש תהליכים ביולוגיים שונים באורגניזמים מודל כגון elegans Caenorhabditis (ג elegans) 1. ניתוח של מוטציות כאלה להוביל לגילוי של גנים חשובים מבחינה תפקודית והאיתות שלהם מסלולי 1,2. באופן מסורתי, mutagenesis ב C. elegans מושגת באמצעות כימיקלים מוטגנים, קרינה, או transposons 2. כימיקלים כגון methanesulfonate אתיל (EMS) ו- N -ethyl- -nitrosourea N (ENU) הם רעילים לבני אדם; קרני גאמא או אולטרה סגול (UV) mutagenesis קרינה דורש ציוד מיוחד; זני transposon-פעיל, כגון זנים המוטטורי 3, יכולים לגרום מוטציות מיותרות במהלך תחזוקה. פיתחנו גישה פשוטה לגרום מוטציות תורשתיות באמצעות פוטוסנסיטייזר גנטית בקידוד 4.
(Reactive oxygen species ROS) יכול לגרום נזק לדנ"א 5.מחולל חמצן גופיה מיני (miniSOG) הוא חלבון פלואורסצנטי ירוק של 106 חומצות אמינו כי תוכננה מן LOV (אור, חמצן, ואת מתח) תחום של ארבידופסיס phototropin 2 6. בחשיפה לאור כחול (~ 450 ננומטר), miniSOG מייצר חמצן גופיית ROS כולל עם fl יבין mononucleotide בתור פקטור 6-8, אשר שוהה בכל התאים. בנינו חלבון היתוך-mSOG שלו על ידי תיוג miniSOG אל C- הסופי של היסטון-72, ג elegans וריאנט של היסטון 3. אנחנו שנוצר transgene חד עותק 9 להביע-mSOG שלו ב germline של ג elegans. בתנאי תרבות נורמלים בחושך, התולעים המהונדסים-mSOG שלו יש גודל גוזלים נורמלי תוחלת חי 4. בחשיפה לאור LED כחול, התולעים שלו-mSOG לייצר מוטציות תורשתיות בקרב הצאצאים שלהם 4. הספקטרום של מוטציות מושרות כולל שינויי נוקלאוטיד, כגון G: C ל- T: A ו- G: C ל- C: G ו- chromoso הקטןלי מחיקות 4. הליך mutagenesis זה הוא פשוט לביצוע, ודורש התקנת בטיחות במעבדה מינימאלית. כאן, אנו מתארים את התקנת תאורת LED ונהלי mutagenesis optogenetic.
Protocol
Representative Results
Discussion
כאן אנו מתארים הליך מפורט של mutagenesis optogenetic באמצעות שלו-mSOG לידי ביטוי germline ולספק דוגמה של מסך גנטי קדימה בקנה מידה קטן. לעומת mutagenesis כימי סטנדרטי, שיטת mutagenesis optogenetic זה יש מספר יתרונות. ראשית, זה לא רעיל, ובכך שמירה על אנשי המעבדה הרחק מוטאגנים כימיים רעילים כגון EMS, ENU ו trime…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The work is supported by HHMI. We thank our lab members for their help with testing the protocol and revising the manuscript.
Materials
| Ultra High Power LED light source | Prizmatix | UHP-mic-LED-460 | 460 ± 5 nm |
| LED controller | Prizmatix | UHPLCC-01 | |
| Digital function generator/amplifier | PASCO | PI-9587C | PI-9587C is no longer available. The replacement is PI-8127. |
| BNC cable male/male | THORLABS | CA3136 | |
| USB-TTL interface | Prizmatix | Optional | |
| Photometer | THORLABS | PM50 and Model D10MM | |
| Filter paper | Whatman | 1001-110 | |
| Copper chloride dihydrate (CuCl2∙2H2O) | Sigma | C6641 | |
| Stereomicroscope | Leica | MZ95 | |
| NGM plate | Dissolve 5g NaCl, 2.5g Peptone, 20g Agar, 10 µg/ml cholesterol in 1 L H2O. After autoclaving, add 1 mM CaCl2, 1 mM MgSO4, 25 mM KH2PO4(pH6.0). | ||
| Lysis solution | 10 mM Tris(pH8.8), 50 mM KCl, 0.1% Triton X100, 2.5 mM MgCl2, 100 µg/ml Proteinase K |
References
- Jorgensen, E. M., Mango, S. E. The art and design of genetic screens: caenorhabditis elegans. Nat Rev Genet. 3 (5), 356-369 (2002).
- Kutscher, L. M., Shaham, S. Forward and reverse mutagenesis in C. elegans. WormBook. , 1-26 (2014).
- Collins, J., Saari, B., Anderson, P. Activation of a transposable element in the germ line but not the soma of Caenorhabditis elegans. Nature. 328 (6132), 726-728 (1987).
- Noma, K., Jin, Y. Optogenetic mutagenesis in Caenorhabditis elegans. Nat Commun. 6, 8868 (2015).
- Cooke, M. S., Evans, M. D., Dizdaroglu, M., Lunec, J. Oxidative DNA damage: mechanisms, mutation, and disease. FASEB J. 17 (10), 1195-1214 (2003).
- Shu, X., et al. A genetically encoded tag for correlated light and electron microscopy of intact cells, tissues, and organisms. PLoS Biol. 9 (4), 1001041 (2011).
- Ruiz-Gonzalez, R., et al. Singlet oxygen generation by the genetically encoded tag miniSOG. J Am Chem Soc. 135 (26), 9564-9567 (2013).
- Pimenta, F. M., Jensen, R. L., Breitenbach, T., Etzerodt, M., Ogilby, P. R. Oxygen-dependent photochemistry and photophysics of “miniSOG,” a protein-encased flavin. Photochem Photobiol. 89 (5), 1116-1126 (2013).
- Frokjaer-Jensen, C., et al. Random and targeted transgene insertion in Caenorhabditis elegans using a modified Mos1 transposon. Nat Methods. 11 (5), 529-534 (2014).
- Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. 유전학. 77 (1), 71-94 (1974).
- Chaudhuri, J., Parihar, M., Pires-daSilva, A. An introduction to worm lab: from culturing worms to mutagenesis. J Vis Exp. (47), (2011).
- Berkowitz, L. A., Knight, A. L., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. Generation of stable transgenic C. elegans using microinjection. J Vis Exp. (18), (2008).
- Mello, C., Fire, A. DNA transformation. Methods Cell Biol. 48, 451-482 (1995).
- Fay, D., Bender, A. Genetic mapping and manipulation: chapter 4–SNPs: introduction and two-point mapping. WormBook. , 1-7 (2006).
- Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. J Vis Exp. (62), (2012).
- Westberg, M., Holmegaard, L., Pimenta, F. M., Etzerodt, M., Ogilby, P. R. Rational design of an efficient, genetically encodable, protein-encased singlet oxygen photosensitizer. J Am Chem Soc. 137 (4), 1632-1642 (2015).
- Xu, S., Chisholm, A. D. Highly efficient optogenetic cell ablation in C. elegans using membrane-targeted miniSOG. Sci Rep. 6, 21271 (2016).
- Mariol, M. C., Walter, L., Bellemin, S., Gieseler, K. A rapid protocol for integrating extrachromosomal arrays with high transmission rate into the C. elegans genome. J Vis Exp. (82), (2013).
- Lin, J. Y., et al. Optogenetic inhibition of synaptic release with chromophore-assisted light inactivation (CALI). Neuron. 79 (2), 241-253 (2013).
- Minevich, G., Park, D. S., Blankenberg, D., Poole, R. J., Hobert, O. CloudMap: A Cloud-Based Pipeline for Analysis of Mutant Genome Sequences. 유전학. 192 (>4), 1249-1269 (2012).
- Qi, Y., Xu, S. MiniSOG-mediated Photoablation in Caenorhabdtis elegans. Bio-protocol. 3 (1), 316 (2013).
- Qi, Y. B., Garren, E. J., Shu, X., Tsien, R. Y., Jin, Y. Photo-inducible cell ablation in Caenorhabditis elegans using the genetically encoded singlet oxygen generating protein miniSOG. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (19), 7499-7504 (2012).
- Nagel, G., et al. Light activation of channelrhodopsin-2 in excitable cells of Caenorhabditis elegans triggers rapid behavioral responses. Curr Biol. 15 (24), 2279-2284 (2005).
