A mutagénese aleatória optogenetic Usando Histona-miniSOG em<em> C. elegans</em
Summary
Geneticamente codificado histona-miniSOG induz mutações hereditárias do genoma de uma forma dependente da luz azul. Este método de mutagénese é simples, rápido, livre de produtos químicos tóxicos, e bem adequada para triagem genética para a frente e integração do transgene.
Abstract
Forward genetic screening in model organisms is the workhorse to discover functionally important genes and pathways in many biological processes. In most mutagenesis-based screens, researchers have relied on the use of toxic chemicals, carcinogens, or irradiation, which requires designated equipment, safety setup, and/or disposal of hazardous materials. We have developed a simple approach to induce heritable mutations in C. elegans using germline-expressed histone-miniSOG, a light-inducible potent generator of reactive oxygen species. This mutagenesis method is free of toxic chemicals and requires minimal laboratory safety and waste management. The induced DNA modifications include single-nucleotide changes and small deletions, and complement those caused by classical chemical mutagenesis. This methodology can also be used to induce integration of extrachromosomal transgenes. Here, we provide the details of the LED setup and protocols for standard mutagenesis and transgene integration.
Introduction
Telas genéticos forward têm sido amplamente utilizados para gerar mutantes genéticos perturbadoras vários processos biológicos em organismos modelo tais como Caenorhabditis elegans (C. elegans) 1. As análises de tais mutantes levar à descoberta de genes funcionalmente importantes e suas vias de sinalização 1,2. Tradicionalmente, a mutagénese em C. elegans é conseguida usando produtos químicos mutagénicos, radiação ou transposons 2. Produtos químicos, tais como metanossulfonato de etilo (EMS) e N-etil-N -nitrosourea (ENU) são tóxicos para os seres humanos; de raios gama ou de raios ultravioleta (UV) mutagénese radiação requer equipamento especial; e estirpes transposon-activa, tais como cepas mutantes 3, pode causar mutações desnecessários durante a manutenção. Nós desenvolvemos uma abordagem simples para induzir mutações hereditárias usando um fotossensibilizador geneticamente codificado 4.
Espécies Reativas de Oxigênio (ROS) podem danificar o DNA 5.O Gerador de mini-oxigênio singlete (miniSOG) é uma proteína verde fluorescente de 106 aminoácidos que foi projetado a partir do LOV (luz, oxigênio, e tensão) de domínio de Arabidopsis phototropin 2 6. Após a exposição à luz azul (~ 450 nm), miniSOG gera ROS, incluindo oxigénio singuleto com FL avin mononucleótido como um cofactor 6-8, que está presente em todas as células. Construiu-se uma proteína de fusão His-MSOG por marcação miniSOG para o terminal C da histona-72, um C. variante elegans de histona 3. Geramos um transgene de cópia única 9 para expressar His-MSOG na linha germinativa de C. elegans. Em condições normais de cultura no escuro, os vermes transgênicos His-MSOG tem o tamanho da ninhada normal e tempo de vida 4. Após a exposição à luz LED azul, os vermes His-MSOG produzir mutações hereditárias entre seus descendentes 4. O espectro de mutações induzidas inclui mudanças de nucleótidos, tais como G: C para T: A e G: C para C: G, e pequena chromosome Exclusões 4. Este processo de mutagénese é simples de executar, e requer uma configuração mínima segurança do laboratório. Aqui, descrevemos a instalação de iluminação LED e procedimentos para mutagénese optogenética.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aqui, nós descrevemos um procedimento detalhado de mutagénese utilizando optogenetic His-MSOG expresso na linha germinativa e fornecem um exemplo de um rastreio genético para a frente em pequena escala. Comparado a mutagénese química padrão, este método de mutagénese optogenetic tem várias vantagens. Em primeiro lugar, não é tóxico, mantendo assim o pessoal de laboratório longe de agentes mutagénicos químicos tóxicos, tais como EMS, ENU e trimetilpsoraleno com luz ultravioleta (TMP / UV). Em segundo luga…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The work is supported by HHMI. We thank our lab members for their help with testing the protocol and revising the manuscript.
Materials
| Ultra High Power LED light source | Prizmatix | UHP-mic-LED-460 | 460 ± 5 nm |
| LED controller | Prizmatix | UHPLCC-01 | |
| Digital function generator/amplifier | PASCO | PI-9587C | PI-9587C is no longer available. The replacement is PI-8127. |
| BNC cable male/male | THORLABS | CA3136 | |
| USB-TTL interface | Prizmatix | Optional | |
| Photometer | THORLABS | PM50 and Model D10MM | |
| Filter paper | Whatman | 1001-110 | |
| Copper chloride dihydrate (CuCl2∙2H2O) | Sigma | C6641 | |
| Stereomicroscope | Leica | MZ95 | |
| NGM plate | Dissolve 5g NaCl, 2.5g Peptone, 20g Agar, 10 µg/ml cholesterol in 1 L H2O. After autoclaving, add 1 mM CaCl2, 1 mM MgSO4, 25 mM KH2PO4(pH6.0). | ||
| Lysis solution | 10 mM Tris(pH8.8), 50 mM KCl, 0.1% Triton X100, 2.5 mM MgCl2, 100 µg/ml Proteinase K |
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