Summary

Выделение липопротеидов высокой плотности для Некодирующих малых РНК квантификации

Published: November 28, 2016
doi:

Summary

This protocol describes the isolation and quantification of high-density lipoprotein small RNAs.

Abstract

Разнообразие малых некодирующих РНК (рРНК) быстро расширяется и их роли в биологических процессах, в том числе регуляции генов, появляются. Самое интересное, что sRNAs также находятся вне клеток и стабильно присутствуют во всех биологических жидкостях. Таким образом, внеклеточные sRNAs представляют собой новый класс биомаркеров заболеваний, и они, вероятно, участвуют в клеточной сигнализации и межклеточных сетей связи. Для того, чтобы оценить их потенциал в качестве биомаркеров, sRNAs может быть определена количественно в плазме крови, мочи и других жидкостей. Тем не менее, чтобы полностью понять влияние внеклеточных sRNAs как эндокринные сигналов, важно , чтобы определить , какие носители транспортировки и защиты их в биологических жидкостях (например, в плазме), что клетки и ткани , способствуют внеклеточные пулы Срна, и клетки и ткани , способные принятия и использования внеклеточный Срна. Для достижения этих целей, важно, чтобы изолировать высокочистых популяции внеклеточного носителейдля профилирования Срна и количественной оценки. Ранее мы показали, что липопротеиды, в частности, липопротеины высокой плотности (HDL), транспорт (функциональные микроРНК микроРНК) между клетками и ЛВП-микроРНК существенно изменяются при болезни. Здесь мы подробно новый протокол, который использует тандемный HDL изоляции с градиенте плотности ультрацентрифугирования (DGUC) и быстрого белка-жидкостной хроматографии (FPLC) для получения высокочистого HDL для нисходящего профилирования и количественной оценки всех sRNAs, в том числе микроРНК, используя как высокий -throughput секвенирования и ПЦР в реальном времени подходы. Этот протокол будет ценным ресурсом для исследования sRNAs на HDL.

Introduction

Внеклеточного-некодирующие малые РНК (sRNAs) представляют собой новый класс биомаркеров заболеваний и потенциальных терапевтических мишеней и , вероятно , облегчит клетки к клетке связи 1. Наиболее широко изученным типом рРНК являются микроРНК (миРНК) , которые приблизительно 22 NTS в длину и обрабатываются из более длинных форм – предшественников и первичных транскриптов 2. микроРНК были продемонстрированы посттранскрипционно регулируют экспрессию генов путем подавления белка трансляции и индукции деградацию мРНК 2. Тем не менее, микроРНК являются лишь одним из многих типов sRNAs; в качестве sRNAs могут быть расщеплены от родительских тРНК (тРНК производные sRNAs, TDR), малые ядерные РНК (рРНК-производных sRNAs, sndRNA), небольшие ядрышковых РНК (snoRNA-производных sRNAs, мяРНК), рибосомных РНК (рРНК происхождения sRNAs РДР ), Y РНК (yDR) и различных других РНК 1. Несколько примеров таких новых sRNAs Сообщалось, что функцию, аналогичную функции микроРНК; Однако биологические фуnctions многих из этих sRNAs еще предстоит определить, хотя роли в регуляции генов, вероятно , 3-6. Самое интересное, что микроРНК и другие sRNAs стабильно присутствуют в внеклеточной жидкости, в том числе слюны, плазмы, мочи и желчи. Внеклеточные sRNAs, вероятно, защищены от РНКазы через их ассоциации с внеклеточным везикул (EV), липопротеинов и / или внеклеточных рибонуклеопротеидных комплексов.

Ранее мы сообщали , что липопротеины, а именно липопротеины высокой плотности (ЛПВП), транспорт микроРНК в плазме 7. В этом исследовании, ЛВП были выделены с использованием последовательного метода градиента плотности ультрацентрифугирования (DGUC), быстро-жидкостной хроматографии протеинов (гель-хроматография на силикагеле, фильтрование, FPLC) и аффинной хроматографии (анти-аполипопротеина (апо-I) иммунопреципитация ) 7. Используя оба в режиме реального времени массивов на основе ПЦР с низкой плотностью и индивидуальных анализов микроРНК, уровни микроРНК были определены количественно на HDL изолированы от заживаюттвой и гиперхолестеринемией предметы 7. Используя этот подход, мы смогли в профиль микроРНК и количественно определенные микроРНК в высокочистых HDL препаратов. Начиная с 2011 года, мы определили, что, хотя аффинная хроматография повышает чистоту HDL, насыщенность антител значительно ограничивает выход, и может быть экономически запретительными. В настоящее время наш протокол рекомендует двухэтапный метод последовательного тандема DGUC с последующим FPLC, который также производит высококачественные образцы HDL для вниз потока выделения РНК и Срна количественной оценки. В связи с последними достижениями в области высокой пропускной последовательности sRNAs (sRNAseq), например, микроРНК, а также повышение уровня информированности других классов , не микроРНК Срна, sRNAseq текущее состояние-оф-искусства в микроРНК и Срна профилирования. Таким образом, наш протокол рекомендует количественное микроРНК и другие sRNAs на образцах HDL с использованием sRNAseq. Тем не менее, общая РНК, выделенной из HDL также могут быть использованы для определения индивидуальных микроРНК и других sRNAs или проверки достоверности результатов sRNAseq с помощью ПЦР в реальном времени Approaches. Здесь мы опишем подробно протокол для сбора, очистки, количественной оценки, анализа данных и проверки высокочистого HDL-sRNAs.

Основная цель данной работы заключается в демонстрации осуществимости и процесс Срна количественной оценки с высокой степенью чистоты HDL, выделенной из плазмы крови человека.

Protocol

1. Очистка HDL (~ 5,5 дней) Градиента плотности Ультрацентрифугирование (DGUC, ~ 5 дней) Добавьте 90 мкл 100x антиокислителей к 9 мл плазмы, выделенных из свежей венозной крови. Отрегулируйте плотность плазмы с КВг от 1,006 г / мл до 1,025 г / мл путем добавления 0,251 г KBr до 9 мл плазмы со стад?…

Representative Results

Этот протокол представляет собой ряд установленных методов , связанных между собой , чтобы позволить квантификации sRNAs на высокочистого HDL по высокой пропускной способностью для секвенирования или ПЦР в реальном времени (рисунок 1). Для демонстрации возможно?…

Discussion

Этот протокол предназначен для количественного определения микроРНК и других sRNAs высокой пропускной последовательности или ПЦР в реальном времени на высокочистого HDL. Как и при любом подходе, особые соображения следует уделять каждому шагу в процессе очистки HDL и РНК, а затем количест?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work was supported by awards from the National Institutes of Health, National Heart, Lung and Blood Institute to K.C.V. HL128996, HL113039, and HL116263. This work was also supported by awards from the American Heart Association to K.C.V. CSA2066001, D.L.M POST26630003, and R.M.A. POST25710170.

Materials

Ultracentrifuge  Beckman Coulter A99839 Optima XPN-80
Ultracentrifuge Rotor Beckman Coulter 331362 SW-41Ti
AKTA Pure FPLC System GE Healthcare 29018224
3X FPLC Superdex 200 Increase Columns In-line GE Healthcare 28990944 10/300 gl
SynergyMx BioTek Instruments 7191000
Tabletop centrifuge Thermo Scientific 75004525 Sorvall ST40R
Refrigerated centrifuge Eppendorf 22629867 5417R (purchased through USA Scientific)
Microfuge  USA Scientific 2631-0006
PippenPrep Sage Science PIP0001
2100 Bioanalyzer  Agilent G2938B
High Sensitivity DNA Assay Agilent 5067-4626
Sequencing Library qPCR Quantification Kit Illumina SY-930-1010
ProFlex Thermal Cycler Applied Biosystems 4484073
QuantStudio 12k Flex Applied Biosystems 4471134
EpMotion Robot Eppendorf 960000111 5070
Ultra-clear centrifuge tubes Beckman Coulter 344059
Potassium Bromide Fisher Chemicals P205-500
15 mL conical tube Thermo Scientific 339650
Micro-centrifugal filters 0.45µm Millipore UFC30HV00
Micro-centrifugal filters 0.22µm Millipore UFC30GV00
miRNAEasy Total RNA Isolation Kits Qiagen 217004
Total Cholesterol colormetric kit Cliniqa (Raichem) R80035
10,000 m.w. cut-off centrifugation filter Amicon UFC801024 purchased through Millipore
PCR strip tubes Axygen PCR-0208-C purchased through Fisher
microRNA RT kit Life Technologies 4366597 For 1000 reactions
PCR master mix Life Technologies 4440041 50 mL bottle
Pierce BCA kit Thermo Scientific 23225
Clean and Concentrator Kit Zymo D4014
Dialysis tubing Spectrum Labs 132118 purchased through Fisher
bcl2fastq2 Illumina n/a Software
Cutadapt https://github.com/marcelm/cutadapt n/a Software
NGSPERL github.com/shengqh/ngsperl n/a Software
CQSTools github.com/shengqh/CQS.Tools n/a Software
Bowtie 1.1.2  http://bowtie-bio.sourceforge.net n/a Software
GeneSpringGX13.1.1 Agilent n/a Software

References

  1. Vickers, K. C., Roteta, L. A., Hucheson-Dilks, H., Han, L., Guo, Y. Mining diverse small RNA species in the deep transcriptome. Trends Biochem Sci. 40, 4-7 (2015).
  2. Bartel, D. P. MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell. 116, 281-297 (2004).
  3. Haussecker, D., et al. Human tRNA-derived small RNAs in the global regulation of RNA silencing. RNA. 16, 673-695 (2010).
  4. Li, Z., et al. Extensive terminal and asymmetric processing of small RNAs from rRNAs, snoRNAs, snRNAs, and tRNAs. Nucleic Acids Res. 40, 6787-6799 (2012).
  5. Martens-Uzunova, E. S., Olvedy, M., Jenster, G. Beyond microRNA–novel RNAs derived from small non-coding RNA and their implication in cancer. Cancer Lett. 340, 201-211 (2013).
  6. Maute, R. L., et al. tRNA-derived microRNA modulates proliferation and the DNA damage response and is down-regulated in B cell lymphoma. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 1404-1409 (2013).
  7. Vickers, K. C., Palmisano, B. T., Shoucri, B. M., Shamburek, R. D., Remaley, A. T. MicroRNAs are transported in plasma and delivered to recipient cells by high-density lipoproteins. Nat Cell Biol. 13, 423-433 (2011).
  8. Smith, P. K., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Anal Biochem. 150, 76-85 (1985).
  9. Chen, C., Khaleel, S. S., Huang, H., Wu, C. H. Software for pre-processing Illumina next-generation sequencing short read sequences. Source Code Biol Med. 9, 8 (2014).
  10. Vickers, K. C., Remaley, A. T. Lipid-based carriers of microRNAs and intercellular communication. Curr Opin Lipidol. 23, 91-97 (2012).
  11. Greening, D. W., Xu, R., Ji, H., Tauro, B. J., Simpson, R. J. A protocol for exosome isolation and characterization: evaluation of ultracentrifugation, density-gradient separation, and immunoaffinity capture methods. Methods Mol Biol. 1295, 179-209 (2015).
  12. Sung, B. H., Ketova, T., Hoshino, D., Zijlstra, A., Weaver, A. M. Directional cell movement through tissues is controlled by exosome secretion. Nat Commun. 6, 7164 (2015).
  13. Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25, 402-408 (2001).
  14. Jung, R., Lubcke, C., Wagener, C., Neumaier, M. Reversal of RT-PCR inhibition observed in heparinized clinical specimens. Biotechniques. 23, (1997).
  15. Johnson, M. L., Navanukraw, C., Grazul-Bilska, A. T., Reynolds, L. P., Redmer, D. A. Heparinase treatment of RNA before quantitative real-time RT-PCR. Biotechniques. 35, 1140-1142 (2003).
  16. Garcia, M. E., Blanco, J. L., Caballero, J., Gargallo-Viola, D. Anticoagulants interfere with PCR used to diagnose invasive aspergillosis. J Clin Microbiol. 40, 1567-1568 (2002).
  17. Yokota, M., Tatsumi, N., Nathalang, O., Yamada, T., Tsuda, I. Effects of heparin on polymerase chain reaction for blood white cells. J Clin Lab Anal. 13, 133-140 (1999).
  18. Bai, X., et al. Predictive value of quantitative PCR-based viral burden analysis for eight human herpesviruses in pediatric solid organ transplant patients. J Mol Diagn. 2, 191-201 (2000).
  19. McShine, R. L., Sibinga, S., Brozovic, B. Differences between the effects of EDTA and citrate anticoagulants on platelet count and mean platelet volume. Clin Lab Haematol. 12, 277-285 (1990).
  20. Fichtlscherer, S., et al. Circulating microRNAs in patients with coronary artery disease. Circ Res. 107, 677-684 (2010).
  21. Pritchard, C. C., Cheng, H. H., Tewari, M. MicroRNA profiling: approaches and considerations. Nat Rev Genet. 13, 358-369 (2012).
  22. Kirschner, M. B., et al. Haemolysis during sample preparation alters microRNA content of plasma. PLoS One. 6, e24145 (2011).
  23. Kannan, M., Atreya, C. Differential profiling of human red blood cells during storage for 52 selected microRNAs. Transfusion. 50, 1581-1588 (2010).
  24. Chen, S. Y., Wang, Y., Telen, M. J., Chi, J. T. The genomic analysis of erythrocyte microRNA expression in sickle cell diseases. PLoS One. 3, e2360 (2008).
  25. Balzano, F., et al. miRNA Stability in Frozen Plasma Samples. Molecules. 20, 19030-19040 (2015).
  26. Redgrave, T. G., Roberts, D. C., West, C. E. Separation of plasma lipoproteins by density-gradient ultracentrifugation. Anal Biochem. 65, 42-49 (1975).
  27. Cheung, M. C., Wolf, A. C. Differential effect of ultracentrifugation on apolipoprotein A-I-containing lipoprotein subpopulations. J Lipid Res. 29, 15-25 (1988).
  28. Kunitake, S. T., Kane, J. P. Factors affecting the integrity of high density lipoproteins in the ultracentrifuge. J Lipid Res. 23, 936-940 (1982).
  29. Laurent, L. C., et al. Meeting report: discussions and preliminary findings on extracellular RNA measurement methods from laboratories in the NIH Extracellular RNA Communication Consortium. J Extracell Vesicles. 4, 26533 (2015).

Play Video

Cite This Article
Michell, D. L., Allen, R. M., Landstreet, S. R., Zhao, S., Toth, C. L., Sheng, Q., Vickers, K. C. Isolation of High-density Lipoproteins for Non-coding Small RNA Quantification. J. Vis. Exp. (117), e54488, doi:10.3791/54488 (2016).

View Video