Summary

O isolamento de lipoproteínas de alta densidade para não codificante pequeno ARN Quantificação

Published: November 28, 2016
doi:

Summary

This protocol describes the isolation and quantification of high-density lipoprotein small RNAs.

Abstract

A diversidade de pequenos RNAs não-codificantes (sRNA) está se expandindo rapidamente e seu papel nos processos biológicos, incluindo a regulação do gene, estão surgindo. Mais interessante, sRNAs também se encontram fora das células e são estavelmente presente em todos os fluidos biológicos. Como tal, sRNAs extracelular representam uma nova classe de biomarcadores da doença e estão provavelmente envolvidos em redes de comunicação intercelular de sinalização celular e. Para avaliar o seu potencial como biomarcadores, sRNAs podem ser quantificados no plasma, urina e outros fluidos. No entanto, para compreender totalmente o impacto de sRNAs extracelulares como sinais endócrinos, que é importante para determinar que os transportadores são transporte e protegendo-os em fluidos biológicos (por exemplo, plasma), que células e tecidos contribuem para piscinas srna extracelulares, e as células e os tecidos capazes de aceitar e utilizando extracelular sRNA. Para atingir essas metas, é fundamental para isolar populações altamente puras de portadores extracelularessRNA para perfilar e quantificação. Temos anteriormente demonstrado que as lipoproteínas, particularmente lipoproteínas de alta densidade (HDL), o transporte de microRNAs funcionais (miRNA) entre as células e HDL-miRNAs são significativamente alterados na doença. Aqui, nós detalhe um novo protocolo que utiliza conjunto de isolamento HDL com ultracentrifugação em gradiente de densidade (DGUC) and-fast-proteína cromatografia líquida (FPLC) para obter HDL elevado grau de pureza para perfilamento a jusante e quantificação de todos os sRNAs, incluindo miRNAs, usando tanto alta sequenciamento -throughput e em tempo real abordagens de PCR. Este protocolo será um recurso valioso para a investigação de sRNAs sobre HDL.

Introduction

Não codificantes pequenos RNAs extracelular (sRNAs) representam uma nova classe de marcadores de doença e potenciais alvos terapêuticos e provavelmente facilitar a comunicação uma célula-a-célula. O tipo mais amplamente estudado de sRNA são microRNAs (miRNA), que são cerca de 22 nts de comprimento e são processados de formas precursoras mais longos e transcritos primários 2. miARNs foram demonstradas para o pós-transcricionalmente regular a expressão do gene através da supressão da tradução de proteínas e a indução do ARNm da degradação 2. No entanto, os miRNAs são apenas um dos muitos tipos de sRNAs; como sRNAs pode ser clivada a partir tRNAs mãe (sRNAs derivados de tRNA, o TDR), RNAs pequenos nucleares (sRNAs sRNA derivados, sndRNA), pequenos RNAs nucleolares (sRNAs snoRNA derivados, snRNA), RNAs ribossomais (sRNAs, RDR rRNA derivado ), Y (RNAs yDR), e outros RNAs 1 variado. Alguns exemplos destes novos sRNAs têm sido relatados para funcionar semelhante ao miARNs; No entanto, o fu biológicanctions de muitos destes sRNAs permanece a ser determinada, embora papéis na regulação do gene são provavelmente 3-6. Mais interessante, miARNs e outros sRNAs são estavelmente presente nos fluidos extracelulares, incluindo a saliva, plasma, urina, e biliar. sRNAs extracelular são provavelmente protegido contra RNases através da sua associação com vesículas extracelulares (EV), lipoproteínas, e / ou complexos de ribonucleoproteína extracelulares.

Anteriormente, relatou que as lipoproteínas, ou seja, lipoproteínas de alta densidade (HDL), miRNAs de transporte no plasma 7. Neste estudo, o HDL foram isoladas utilizando um método sequencial de ultracentrifugação em gradiente de densidade (DGUC), cromatografia líquida rápida de proteínas (filtração em gel A cromatografia de exclusão de tamanho, FPLC), e imunoprecipitação de cromatografia de afinidade (anti-apolipoproteína AI (apo AI) ) 7. Utilizando ambas as matrizes de baixa densidade baseada em PCR em tempo real e ensaios de miARN individuais, níveis de miARN foram quantificados em HDL isolada a partir de curarthy e indivíduos com hipercolesterolemia 7. Usando essa abordagem, fomos capazes de perfil miRNAs e quantificar miRNAs específicos em preparações de HDL altamente puros. Desde 2011, nós determinamos que, apesar de cromatografia de afinidade melhora a pureza HDL, saturação de anticorpo limita grandemente o rendimento, e pode ser um custo proibitivo. Actualmente, o protocolo recomenda um método conjunto sequencial de dois passos de DGUC seguido por FPLC, que também produz amostras de HDL elevado de qualidade para a jusante de isolamento de ARN e sRNA quantificação. Devido aos recentes avanços no sequenciamento de alto rendimento de sRNAs (sRNAseq), por exemplo, os miRNAs, eo aumento da consciência de outras classes não-miRNA Srna, sRNAseq é o atual estado-da-arte em miRNA e sRNA profiling. Como tal, o nosso protocolo recomenda quantificar miRNAs e outros sRNAs em amostras de HDL usando sRNAseq. No entanto, o ARN total isolado a partir de HDL também pode ser utilizado para quantificar miARNs individuais e outros sRNAs ou validar os resultados sRNAseq utilizando PCR em tempo real umpproaches. Aqui nós descrevemos em detalhe um protocolo para a recolha, purificação, quantificação, análise de dados e validação de alta pureza HDL-sRNAs.

O objetivo geral deste trabalho é demonstrar a viabilidade e processo de sRNA quantificação de HDL altamente pura isolada a partir de plasma humano.

Protocol

1. A purificação de HDL (~ 5,5 dias) Gradiente de densidade de Ultracentrifugação (DGUC, ~ 5 dias) Adicionar 90 uL de 100x anti-oxidantes para 9 ml de plasma isolados a partir de sangue venoso fresco. Ajustar a densidade de plasma com KBr partir de 1,006 g / mL a 1,025 g / mL por adição de 0,251 g de KBr a 9 mL de plasma a partir do passo 1.1.1 (0,0278 g / ml de plasma de KBr). Balance o plasma até que todo o sal é dissolvido à temperatura ambiente e transferir para tubos de ultrac…

Representative Results

Este protocolo é uma série de métodos estabelecidos ligados em conjunto para permitir a quantificação de HDL em sRNAs altamente pura por sequenciação de alto rendimento ou PCR em tempo real (Figura 1). Para demonstrar a viabilidade eo impacto deste protocolo, HDL foi purificada a partir de plasma humano pelo conjunto método DGUC e FPLC. As fracções recolhidas correspondentes a FPLC de HDL (colesterol) por distribuição foram concentradas e o ARN total foi isol…

Discussion

Este protocolo é concebido para quantificar miARNs e outros sRNAs por sequenciação de alto rendimento ou PCR em tempo real sobre o HDL altamente pura. Tal como acontece com qualquer abordagem, considerações especiais deve ser dada para cada passo no processo de purificação de HDL e de ARN e, em seguida quantificando sRNAs. Este protocolo é projetado para projetos começando com ≥ 2 mL de plasma. No entanto, análises de ARN de elevada qualidade pode com sucesso ser completado com HDL purificada a partir de tã…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work was supported by awards from the National Institutes of Health, National Heart, Lung and Blood Institute to K.C.V. HL128996, HL113039, and HL116263. This work was also supported by awards from the American Heart Association to K.C.V. CSA2066001, D.L.M POST26630003, and R.M.A. POST25710170.

Materials

Ultracentrifuge  Beckman Coulter A99839 Optima XPN-80
Ultracentrifuge Rotor Beckman Coulter 331362 SW-41Ti
AKTA Pure FPLC System GE Healthcare 29018224
3X FPLC Superdex 200 Increase Columns In-line GE Healthcare 28990944 10/300 gl
SynergyMx BioTek Instruments 7191000
Tabletop centrifuge Thermo Scientific 75004525 Sorvall ST40R
Refrigerated centrifuge Eppendorf 22629867 5417R (purchased through USA Scientific)
Microfuge  USA Scientific 2631-0006
PippenPrep Sage Science PIP0001
2100 Bioanalyzer  Agilent G2938B
High Sensitivity DNA Assay Agilent 5067-4626
Sequencing Library qPCR Quantification Kit Illumina SY-930-1010
ProFlex Thermal Cycler Applied Biosystems 4484073
QuantStudio 12k Flex Applied Biosystems 4471134
EpMotion Robot Eppendorf 960000111 5070
Ultra-clear centrifuge tubes Beckman Coulter 344059
Potassium Bromide Fisher Chemicals P205-500
15 mL conical tube Thermo Scientific 339650
Micro-centrifugal filters 0.45µm Millipore UFC30HV00
Micro-centrifugal filters 0.22µm Millipore UFC30GV00
miRNAEasy Total RNA Isolation Kits Qiagen 217004
Total Cholesterol colormetric kit Cliniqa (Raichem) R80035
10,000 m.w. cut-off centrifugation filter Amicon UFC801024 purchased through Millipore
PCR strip tubes Axygen PCR-0208-C purchased through Fisher
microRNA RT kit Life Technologies 4366597 For 1000 reactions
PCR master mix Life Technologies 4440041 50 mL bottle
Pierce BCA kit Thermo Scientific 23225
Clean and Concentrator Kit Zymo D4014
Dialysis tubing Spectrum Labs 132118 purchased through Fisher
bcl2fastq2 Illumina n/a Software
Cutadapt https://github.com/marcelm/cutadapt n/a Software
NGSPERL github.com/shengqh/ngsperl n/a Software
CQSTools github.com/shengqh/CQS.Tools n/a Software
Bowtie 1.1.2  http://bowtie-bio.sourceforge.net n/a Software
GeneSpringGX13.1.1 Agilent n/a Software

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Michell, D. L., Allen, R. M., Landstreet, S. R., Zhao, S., Toth, C. L., Sheng, Q., Vickers, K. C. Isolation of High-density Lipoproteins for Non-coding Small RNA Quantification. J. Vis. Exp. (117), e54488, doi:10.3791/54488 (2016).

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