Summary

Isolement de lipoprotéines de haute densité pour les non-codant petit ARN Quantification

Published: November 28, 2016
doi:

Summary

This protocol describes the isolation and quantification of high-density lipoprotein small RNAs.

Abstract

La diversité des petits ARN non codants (ARNs) est en pleine expansion et leur rôle dans les processus biologiques, y compris la régulation des gènes, sont en train d'émerger. Le plus intéressant, ARNs sont également trouvés à l'extérieur des cellules et sont présents de manière stable dans tous les fluides biologiques. En tant que tel, ARNs extracellulaires représentent une nouvelle classe de biomarqueurs de la maladie et sont probablement impliqués dans la signalisation cellulaire et les réseaux de communication intercellulaire. Pour évaluer leur potentiel en tant que biomarqueurs, ARNs peuvent être quantifiés dans le plasma, l'urine et d'autres fluides. Néanmoins, pour comprendre pleinement l'impact des ARNs extracellulaires comme des signaux endocriniens, il est important de déterminer quels transporteurs transportent et de les protéger dans les fluides biologiques (par exemple, plasma), dont les cellules et les tissus contribuent à des pools de ARNs extracellulaires, et les cellules et les tissus capables d'accepter et d'utiliser extracellulaire ARNs. Pour atteindre ces objectifs, il est essentiel d'isoler des populations très pures des transporteurs extracellulairesARNs pour le profilage et la quantification. Nous avons déjà démontré que les lipoprotéines, en particulier les lipoprotéines de haute densité (HDL), le transport de microARN (miARN fonctionnels) entre les cellules et HDL-miARN sont significativement altérées dans la maladie. Ici, nous détaillons un nouveau protocole qui utilise tandem isolement HDL avec gradient de densité ultracentrifugation (DGUC) et rapide aux protéines chromatographie liquide (FPLC) pour obtenir HDL très pur pour le profilage aval et la quantification de tous les ARNs, y compris miARN, utilisant à la fois haute Le séquençage -throughput et des approches de PCR en temps réel. Ce protocole sera une ressource précieuse pour l'étude des ARNs sur HDL.

Introduction

Extracellulaires non codantes petits ARN (ARNs) représentent une nouvelle classe de biomarqueurs de la maladie et des cibles thérapeutiques potentielles et susceptibles de faciliter la cellule à cellule communication 1. Le type le plus largement étudié des ARNs sont microARN (miARN) qui sont environ 22 nts de longueur et sont traités de plus longues formes précurseurs et transcrits primaires 2. miARN a été démontré que la post-transcriptionnel réguler l' expression génique par la suppression de la conversion des protéines et de l' induction de la dégradation de l' ARNm 2. Néanmoins, les miARN sont juste un des nombreux types de ARNs; comme ARNs peuvent être clivés de ARNt mères (des ARNs ARNt dérivés, TDR), petits ARN nucléaires (ARNs ARNs dérivés, sndRNA), petits ARN nucléolaires (des ARNs snoRNA dérivés, snARN), ARNs ribosomiques (ARNs, rdr ARNr dérivé ), Y (ARN ydr) et d' autres divers ARNs 1. Quelques exemples de ces nouveaux ARNs ont été rapportés à fonction similaire à celle miARN; cependant, le fu biologiquenctions de beaucoup de ces ARNs reste à déterminer, bien que les rôles dans la régulation des gènes sont susceptibles 3-6. Le plus intéressant, et d'autres miARN ARNs sont présents de manière stable dans les fluides extra-cellulaires, y compris la salive, le plasma, l'urine et la bile. ARNs extracellulaires sont probablement protégés de RNases par leur association avec des vésicules extracellulaires (EV), les lipoprotéines, et / ou complexes de ribonucléoprotéines extracellulaires.

Auparavant, nous avons signalé que les lipoprotéines, à savoir les lipoprotéines de haute densité (HDL), miARN de transport dans le plasma 7. Dans cette étude, les HDL ont été isolés à l'aide d'un procédé séquentiel d'une ultracentrifugation en gradient de densité (DGUC), la chromatographie liquide rapide de protéines (par exclusion de taille sur gel de chromatographie de filtration, FPLC) et la Chromatographie d'affinité (AI anti- apolipoprotéine (apoA-I) immunoprécipitation ) 7. En utilisant les deux en temps réel basés sur la PCR des réseaux à faible densité et des essais de miARN individuels, les niveaux de miARN ont été quantifiés sur HDL isolés de guérirton et les sujets hypercholestérolémiques 7. En utilisant cette approche, nous avons pu le profil de miARN et quantifier miARN spécifiques dans des préparations de HDL très pures. Depuis 2011, nous avons déterminé que, bien que la chromatographie d'affinité améliore la pureté de HDL, la saturation des anticorps limite fortement le rendement, et peut être un coût prohibitif. Actuellement, notre protocole recommande une méthode tandem séquentielle en deux étapes de DGUC suivie par FPLC, qui produit également des échantillons de HDL de haute qualité pour l'isolement en aval de l'ARN et ARNs quantification. En raison des récents progrès dans le séquençage à haut débit de ARNs (sRNAseq), par exemple, miARN et la prise de conscience accrue des autres classes non-miARN ARNs, sRNAseq est l'état actuel de la technique dans miRNA et ARNs profilage. En tant que tel, notre protocole recommande miARN quantifier et d'autres ARNs sur des échantillons HDL utilisant sRNAseq. Néanmoins, l'ARN total isolé de HDL peut également être utilisé pour quantifier les miARN individuels et d'autres ARNs ou de valider les résultats de sRNAseq en utilisant PCR en temps réel unepproches. Ici, nous décrivons en détail un protocole pour la collecte, la purification, la quantification, l'analyse des données, et la validation de haute pureté HDL-ARNs.

L'objectif global de cet article est de démontrer la faisabilité et le processus de ARNs quantification dans HDL très pur isolé du plasma humain.

Protocol

1. La purification HDL (~ 5,5 jours) Densité-Gradient ultracentrifugation (DGUC, ~ 5 jours) Ajouter 90 ul de 100x anti-oxydants à 9 ml de plasma isolé à partir de sang veineux frais. Ajuster la densité du plasma avec KBr de 1,006 g / mL à 1,025 g / mL en ajoutant 0,251 g KBr à 9 ml de plasma de l'étape 1.1.1 (0,0278 g / KBr ml de plasma). Rock the plasma jusqu'à ce que tout le sel est dissous à la température ambiante et transfert à ultracentrifugation tubes et faire en …

Representative Results

Ce protocole est une série de méthodes établies reliées entre elles pour permettre la quantification des HDL sur les ARNs de haute pureté par séquençage à haut débit ou PCR en temps réel (figure 1). Pour démontrer la faisabilité et l'impact de ce protocole, HDL a été purifié à partir de plasma humain par le tandem DGUC et FPLC méthode. Les fractions recueillies FPLC correspondant aux HDL (par la distribution du cholestérol) ont été concentrées et…

Discussion

Ce protocole est conçu pour quantifier miARN et d'autres ARNs par séquençage à haut débit ou PCR en temps réel sur le HDL très pur. Comme pour toute approche, des considérations particulières devraient être données à chaque étape du processus de purification de HDL et de l'ARN, puis quantifier ARNs. Ce protocole est conçu pour des projets commençant par ≥ 2 mL de plasma. Néanmoins, des analyses d'ARN de haute qualité peuvent être complétés avec succès HDL purifié à partir d'aussi…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work was supported by awards from the National Institutes of Health, National Heart, Lung and Blood Institute to K.C.V. HL128996, HL113039, and HL116263. This work was also supported by awards from the American Heart Association to K.C.V. CSA2066001, D.L.M POST26630003, and R.M.A. POST25710170.

Materials

Ultracentrifuge  Beckman Coulter A99839 Optima XPN-80
Ultracentrifuge Rotor Beckman Coulter 331362 SW-41Ti
AKTA Pure FPLC System GE Healthcare 29018224
3X FPLC Superdex 200 Increase Columns In-line GE Healthcare 28990944 10/300 gl
SynergyMx BioTek Instruments 7191000
Tabletop centrifuge Thermo Scientific 75004525 Sorvall ST40R
Refrigerated centrifuge Eppendorf 22629867 5417R (purchased through USA Scientific)
Microfuge  USA Scientific 2631-0006
PippenPrep Sage Science PIP0001
2100 Bioanalyzer  Agilent G2938B
High Sensitivity DNA Assay Agilent 5067-4626
Sequencing Library qPCR Quantification Kit Illumina SY-930-1010
ProFlex Thermal Cycler Applied Biosystems 4484073
QuantStudio 12k Flex Applied Biosystems 4471134
EpMotion Robot Eppendorf 960000111 5070
Ultra-clear centrifuge tubes Beckman Coulter 344059
Potassium Bromide Fisher Chemicals P205-500
15 mL conical tube Thermo Scientific 339650
Micro-centrifugal filters 0.45µm Millipore UFC30HV00
Micro-centrifugal filters 0.22µm Millipore UFC30GV00
miRNAEasy Total RNA Isolation Kits Qiagen 217004
Total Cholesterol colormetric kit Cliniqa (Raichem) R80035
10,000 m.w. cut-off centrifugation filter Amicon UFC801024 purchased through Millipore
PCR strip tubes Axygen PCR-0208-C purchased through Fisher
microRNA RT kit Life Technologies 4366597 For 1000 reactions
PCR master mix Life Technologies 4440041 50 mL bottle
Pierce BCA kit Thermo Scientific 23225
Clean and Concentrator Kit Zymo D4014
Dialysis tubing Spectrum Labs 132118 purchased through Fisher
bcl2fastq2 Illumina n/a Software
Cutadapt https://github.com/marcelm/cutadapt n/a Software
NGSPERL github.com/shengqh/ngsperl n/a Software
CQSTools github.com/shengqh/CQS.Tools n/a Software
Bowtie 1.1.2  http://bowtie-bio.sourceforge.net n/a Software
GeneSpringGX13.1.1 Agilent n/a Software

References

  1. Vickers, K. C., Roteta, L. A., Hucheson-Dilks, H., Han, L., Guo, Y. Mining diverse small RNA species in the deep transcriptome. Trends Biochem Sci. 40, 4-7 (2015).
  2. Bartel, D. P. MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell. 116, 281-297 (2004).
  3. Haussecker, D., et al. Human tRNA-derived small RNAs in the global regulation of RNA silencing. RNA. 16, 673-695 (2010).
  4. Li, Z., et al. Extensive terminal and asymmetric processing of small RNAs from rRNAs, snoRNAs, snRNAs, and tRNAs. Nucleic Acids Res. 40, 6787-6799 (2012).
  5. Martens-Uzunova, E. S., Olvedy, M., Jenster, G. Beyond microRNA–novel RNAs derived from small non-coding RNA and their implication in cancer. Cancer Lett. 340, 201-211 (2013).
  6. Maute, R. L., et al. tRNA-derived microRNA modulates proliferation and the DNA damage response and is down-regulated in B cell lymphoma. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 1404-1409 (2013).
  7. Vickers, K. C., Palmisano, B. T., Shoucri, B. M., Shamburek, R. D., Remaley, A. T. MicroRNAs are transported in plasma and delivered to recipient cells by high-density lipoproteins. Nat Cell Biol. 13, 423-433 (2011).
  8. Smith, P. K., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Anal Biochem. 150, 76-85 (1985).
  9. Chen, C., Khaleel, S. S., Huang, H., Wu, C. H. Software for pre-processing Illumina next-generation sequencing short read sequences. Source Code Biol Med. 9, 8 (2014).
  10. Vickers, K. C., Remaley, A. T. Lipid-based carriers of microRNAs and intercellular communication. Curr Opin Lipidol. 23, 91-97 (2012).
  11. Greening, D. W., Xu, R., Ji, H., Tauro, B. J., Simpson, R. J. A protocol for exosome isolation and characterization: evaluation of ultracentrifugation, density-gradient separation, and immunoaffinity capture methods. Methods Mol Biol. 1295, 179-209 (2015).
  12. Sung, B. H., Ketova, T., Hoshino, D., Zijlstra, A., Weaver, A. M. Directional cell movement through tissues is controlled by exosome secretion. Nat Commun. 6, 7164 (2015).
  13. Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25, 402-408 (2001).
  14. Jung, R., Lubcke, C., Wagener, C., Neumaier, M. Reversal of RT-PCR inhibition observed in heparinized clinical specimens. Biotechniques. 23, (1997).
  15. Johnson, M. L., Navanukraw, C., Grazul-Bilska, A. T., Reynolds, L. P., Redmer, D. A. Heparinase treatment of RNA before quantitative real-time RT-PCR. Biotechniques. 35, 1140-1142 (2003).
  16. Garcia, M. E., Blanco, J. L., Caballero, J., Gargallo-Viola, D. Anticoagulants interfere with PCR used to diagnose invasive aspergillosis. J Clin Microbiol. 40, 1567-1568 (2002).
  17. Yokota, M., Tatsumi, N., Nathalang, O., Yamada, T., Tsuda, I. Effects of heparin on polymerase chain reaction for blood white cells. J Clin Lab Anal. 13, 133-140 (1999).
  18. Bai, X., et al. Predictive value of quantitative PCR-based viral burden analysis for eight human herpesviruses in pediatric solid organ transplant patients. J Mol Diagn. 2, 191-201 (2000).
  19. McShine, R. L., Sibinga, S., Brozovic, B. Differences between the effects of EDTA and citrate anticoagulants on platelet count and mean platelet volume. Clin Lab Haematol. 12, 277-285 (1990).
  20. Fichtlscherer, S., et al. Circulating microRNAs in patients with coronary artery disease. Circ Res. 107, 677-684 (2010).
  21. Pritchard, C. C., Cheng, H. H., Tewari, M. MicroRNA profiling: approaches and considerations. Nat Rev Genet. 13, 358-369 (2012).
  22. Kirschner, M. B., et al. Haemolysis during sample preparation alters microRNA content of plasma. PLoS One. 6, e24145 (2011).
  23. Kannan, M., Atreya, C. Differential profiling of human red blood cells during storage for 52 selected microRNAs. Transfusion. 50, 1581-1588 (2010).
  24. Chen, S. Y., Wang, Y., Telen, M. J., Chi, J. T. The genomic analysis of erythrocyte microRNA expression in sickle cell diseases. PLoS One. 3, e2360 (2008).
  25. Balzano, F., et al. miRNA Stability in Frozen Plasma Samples. Molecules. 20, 19030-19040 (2015).
  26. Redgrave, T. G., Roberts, D. C., West, C. E. Separation of plasma lipoproteins by density-gradient ultracentrifugation. Anal Biochem. 65, 42-49 (1975).
  27. Cheung, M. C., Wolf, A. C. Differential effect of ultracentrifugation on apolipoprotein A-I-containing lipoprotein subpopulations. J Lipid Res. 29, 15-25 (1988).
  28. Kunitake, S. T., Kane, J. P. Factors affecting the integrity of high density lipoproteins in the ultracentrifuge. J Lipid Res. 23, 936-940 (1982).
  29. Laurent, L. C., et al. Meeting report: discussions and preliminary findings on extracellular RNA measurement methods from laboratories in the NIH Extracellular RNA Communication Consortium. J Extracell Vesicles. 4, 26533 (2015).

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Michell, D. L., Allen, R. M., Landstreet, S. R., Zhao, S., Toth, C. L., Sheng, Q., Vickers, K. C. Isolation of High-density Lipoproteins for Non-coding Small RNA Quantification. J. Vis. Exp. (117), e54488, doi:10.3791/54488 (2016).

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