Rilevamento Cortex Frammenti Durante la germinazione delle spore batteriche
Summary
Herein, we describe a colorimetric assay to detect the presence of reducing sugars during bacterial spore germination.
Abstract
The process of endospore germination in Clostridium difficile, and other Clostridia, increasingly is being found to differ from the model spore-forming bacterium, Bacillus subtilis. Germination is triggered by small molecule germinants and occurs without the need for macromolecular synthesis. Though differences exist between the mechanisms of spore germination in species of Bacillus and Clostridium, a common requirement is the hydrolysis of the peptidoglycan-like cortex which allows the spore core to swell and rehydrate. After rehydration, metabolism can begin and this, eventually, leads to outgrowth of a vegetative cell. The detection of hydrolyzed cortex fragments during spore germination can be difficult and the modifications to the previously described assays can be confusing or difficult to reproduce. Thus, based on our recent report using this assay, we detail a step-by-step protocol for the colorimetric detection of cortex fragments during bacterial spore germination.
Introduction
Endospore sono metabolicamente forme dormienti di batteri che permettono ai batteri di persistono in ambienti sfavorevoli. In molti batteri sporigeni, formazione di spore è indotta da privazione di nutrienti, ma questo processo può essere controllato da cambiamenti di pH, esposizione ad ossigeno o altre sollecitazioni 1. Mentre nella loro forma spore metabolicamente dormiente, i batteri resistono ai raggi UV, essiccazione, temperature più elevate, e il congelamento 2. La maggior parte delle conoscenze sul processo di sporulazione deriva da studi in organismo modello, Bacillus subtilis. Il processo inizia con sporulazione replicazione del DNA e la formazione di un 3,4 filamento assiale. Un setto asimmetrica quindi divide la cella in due compartimenti di dimensioni disuguale. Il vano più grande, la cellula madre, avvolge il vano più piccolo, il forespore. Sia la cellula madre e forespore coordinare l'espressione genica a maturare le spore e la cellula madre alla fine lisa, rilasciando il Dormant spore nell'ambiente circostante 1.
La struttura e la composizione delle spore si conserva in molte specie batteriche. Il nucleo spora ha un contenuto d'acqua inferiore a quella cellula vegetativa ed è ricco di acido dipicolinico (DPA) 1,2. Durante la formazione di spore, DPA viene pompato nel nucleo spore in cambio di acqua. Che circonda il nucleo è una membrana spore interno dove, nella maggior parte dei formare spore dei batteri, i recettori che riconoscono le piccole molecole che stimolano la germinazione (germinants) si trovano 2. Situato appena fuori membrana interna della spora è uno strato di peptidoglicano della parete cellulare. Uno strato peptidoglicano specializzata (corteccia) circonda la peptidoglicano della parete cellulare ed è composto da molti degli stessi componenti come peptidoglicano della parete cellulare [alternati N-acetilglucosamina (NAG) e acido N-acetilmuramico (NAM)]. Tuttavia, circa il 50% dei residui NAM nella corteccia sono stati convertiti in muramico-δ-lattame 5,6 </sup>. Durante la germinazione delle spore, questi residui muramico-δ-lattamici sono riconosciuti dalle spore corteccia enzimi litici (SCLEs), consentendo in tal modo la corteccia di essere degradata (un processo essenziale per completare la germinazione), ma non la parete cellulare. Intorno corteccia è una membrana esterna e diversi strati di proteine di rivestimento 2.
Controllo del processo di germinazione è di fondamentale importanza per la sporulazione. La germinazione è iniziato quando i recettori germinant interagiscono con i loro rispettivi germinants 2. In molti sporulazione, questi germinants sono aminoacidi, zuccheri, nucleotidi, ioni o loro combinazioni 2. C. difficile germinazione è avviata da combinazioni di alcuni acidi biliari, [ad esempio, acido taurocolico (TA)] e amminoacidi (ad esempio, glicina) 7-10. Anche se ci sono differenze tra il C. percorso di germinazione difficile e le vie studiate in altri sporebatteri, come B. subtilis, comune a tutti è il requisito assoluto per degradare la corteccia spore per consentire una cellula vegetativa a crescere dal spore germinato 2,8. Il degrado della corteccia può essere compiuta dal SCLEs CwlJ / SleB (come si trova in B. subtilis) o SLEC (come si trova in molti clostridi). Cortex idrolisi riduce il vincolo sulla parete cellulare e spore. Questo permette di reidratazione pieno centro, un passo necessario per riattivare molte delle proteine necessarie per il metabolismo cellulare 2.
Quando spore germinano, i cambiamenti spore dormienti da uno stato di fase luminoso ad uno stato di fase buia e questo processo può essere misurato da un cambiamento di densità ottica (OD) a 600 nm 11. Un rapporto precedente suggerisce che gran parte di questo cambiamento di OD è dovuto al rilascio di DPA dalla spore 12. Durante il nostro recente studio, abbiamo cercato di confrontare i tempi di C. difficile la germinazione delle spore e monitorato ilrilascio di DPA e corteccia frammenti 9. Per questo studio è stato fondamentale per monitorare il rilascio di frammenti di corteccia come hanno cominciato ad essere rilasciato dalla germinazione delle spore.
Il saggio colorimetrico qui usato si basava su un metodo per rilevare gli zuccheri con estremità riducenti sviluppato Ghuysen et al. 13. Perché altri hanno descritto i protocolli per la rilevazione di zuccheri riducenti 14 o hanno modificato i protocolli 15, la letteratura su questo argomento può essere fonte di confusione. Qui, noi dettaglio un metodo step-by-step per la determinazione colorimetrica di zuccheri riduttori liberati da germinare C. spore difficile. Anche se questo studio utilizza C. spore difficile, gli zuccheri riducenti liberati durante la germinazione di spore da altri batteri sporigeni sono in grado di essere rilevato con questo protocollo 9,16,17.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dopo stimolazione, spore sottoposti al processo di germinazione perdono le loro caratteristiche di resistenza senza la necessità per la sintesi macromolecolare. Quando la germinazione delle spore viene attivato, il nucleo spore rilascia DPA in cambio di acqua 2. A causa dell'elevato contenuto DPA della spora dormienti, il nucleo spore è sotto forte pressione osmotica ed il peptidoglicano specializzata, corteccia, aiuta a prevenire il nucleo di gonfiore agendo, presumibilmente, come barriera all'espa…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Il progetto descritto è supportato da premio Numero 5R01AI116895 dal National Institute of Allergy e Malattie infettive. Il contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresentano necessariamente il punto di vista ufficiale del National Institute of Allergy e Malattie infettive o il National Institutes of Health.
Materials
| 2.0 mL screw cap tube | USA scientific | 1420-3700 | |
| p1000 eppendorf pippet | Eppendorf | ||
| p200 eppendorf pippet | Eppendorf | ||
| p20 eppendorf pippet | Eppendorf | ||
| 100-1250uL pipet tips | VWR | 89079-486 | |
| 1-200uL pipet tips | VWR | 89079-458 | |
| N-acetyl-D-glucosamine | Sigma | A3286-25G | |
| Hydrochloric Acid – 10N | BDH-Aristar | BDH3032-3.8LP | |
| Acetic Anhydride | Alfa Aesar | L04295 | |
| Sodium Bicarbonate | BDH | BDH0280-500G | |
| Potassium Tetraborate tetrahydrate | Alfa Aesar | 39435 | |
| Sodium Hydroxide | BDH | BDH8019-500G | |
| 4-(Dimethylamino)benzaldehyde | Sigma | 156477-100G | |
| Saturated Phenol | Fisher | BP1750-400 | |
| 2-Mercaptoethanol | Aldrich | M6250-100ML | |
| SpectraMax M3 | Molecular Devices | ||
| Acetic Acid, Glacial | BDH | BDH3098-3.8LP | |
| Heated, Circulating Water Bath | VWR Scientific | Model 1136 | |
| Microtest 96 | Falcon | 353072 | 96 well clear tissue culture plates |
| Culture tubes | VWR | 89000-506 | |
| Lyophilizer | |||
| Heat Blocks | |||
| Vortex Machine | |||
References
- Al-Hinai, M. A., Jones, S. W., Papoutsakis, E. T. The Clostridium sporulation programs: diversity and preservation of endospore differentiation. Microbiol Mol Biol Rev. 79, 19-37 (2015).
- Setlow, P. Germination of spores of Bacillus species: what we know and do not know. J Bacteriol. 196, 1297-1305 (2014).
- Tan, I. S., Ramamurthi, K. S. Spore formation in Bacillus subtilis. Environ Microbiol Rep. 6, 212-225 (2014).
- Fimlaid, K. A., Shen, A. Diverse mechanisms regulate sporulation sigma factor activity in the Firmicutes. Curr Opin Microbiol. 24, 88-95 (2015).
- Popham, D. L., Helin, J., Costello, C. E., Setlow, P. Analysis of the peptidoglycan structure of Bacillus subtilis endospores. J Bacteriol. 178, 6451-6458 (1996).
- Atrih, A., Zollner, P., Allmaier, G., Foster, S. J. Structural analysis of Bacillus subtilis 168 endospore peptidoglycan and its role during differentiation. J Bacteriol. 178, 6173-6183 (1996).
- Sorg, J. A., Sonenshein, A. L. Bile salts and glycine as cogerminants for Clostridium difficile spores. J. Bacteriol. 190, 2505-2512 (2008).
- Paredes-Sabja, D., Shen, A., Sorg, J. A. Clostridium difficile spore biology: sporulation, germination, and spore structural proteins. Trends Microbiol. 22 (7), (2014).
- Francis, M. B., Allen, C. A., Sorg, J. A. Spore cortex hydrolysis precedes DPA release during Clostridium difficile spore germination. J Bacteriol. 197 (14), (2015).
- Francis, M. B., Allen, C. A., Shrestha, R., Sorg, J. A. Bile acid recognition by the Clostridium difficile Germinant Receptor, CspC, is important for establishing infection. PLoS Pathog. 9, e1003356 (2013).
- Moir, A., Smith, D. A. The Genetics of bacterial spore germination. Annu. Rev. Microbiol. 44, 531-553 (1990).
- Zhang, P., Kong, L., Wang, G., Setlow, P., Li, Y. Q. Combination of Raman tweezers and quantitative differential interference contrast microscopy for measurement of dynamics and heterogeneity during the germination of individual bacterial spores. Journal of biomedical optics. 15, 056010 (2010).
- Ghuysen, J. -. M., Tipper, D. J., Strominger, J. L. Enzymes that degrade bacterial cell walls. Methods Enzymol. 8, 685-699 (1966).
- Park, J. T., Johnson, M. J. A submicrodetermination of glucose. J Biol Chem. 181, 149-151 (1949).
- Thompson, J. S., Shockman, G. D. A modification of the Park and Johnson reducing sugar determination suitable for the assay of insoluble materials: its application to bacterial cell walls. Anal Biochem. 22, 260-268 (1968).
- Paredes-Sabja, D., Setlow, P., Sarker, M. R. SleC is essential for cortex peptidoglycan hydrolysis during germination of spores of the pathogenic bacterium Clostridium perfringens. J Bacteriol. 191, 2711-2720 (2009).
- Paredes-Sabja, D., Sarker, M. R. Effect of the cortex-lytic enzyme SleC from non-food-borne Clostridium perfringens on the germination properties of SleC-lacking spores of a food poisoning isolate. Can J Microbiol. 56, 952-958 (2010).
- Hindle, A. A., Hall, E. A. Dipicolinic acid (DPA) assay revisited and appraised for spore detection. The Analyst. 124, 1599-1604 (1999).
- Kort, R., et al. Assessment of heat resistance of bacterial spores from food product isolates by fluorescence monitoring of dipicolinic acid release. Appl Environ Microbiol. 71, 3556-3564 (2005).
- Elson, L. A., Morgan, W. T. A colorimetric method for the determination of glucosamine and chondrosamine. The Biochemical journal. 27, 1824-1828 (1933).
- Ramirez, N., Abel-Santos, E. Requirements for germination of Clostridium sordellii spores in vitro. J. Bacteriol. 192, 418-425 (2010).
- Akoachere, M., et al. Indentification of an in vivo inhibitor of Bacillus anthracis spore germination. J. Biol. Chem. 282, 12112-12118 (2007).
- Duncan, C. L., Strong, D. H. Improved medium for sporulation of Clostridium perfringens. Appl Microbiol. 16, 82-89 (1968).
- Heffron, J. D., Lambert, E. A., Sherry, N., Popham, D. L. Contributions of four cortex lytic enzymes to germination of Bacillus anthracis spores. J Bacteriol. 192, 763-770 (2010).
- Meador-Parton, J., Popham, D. L. Structural analysis of Bacillus subtilis spore peptidoglycan during sporulation. J Bacteriol. 182, 4491-4499 (2000).
- Lambert, E. A., Popham, D. L. The Bacillus anthracis SleL (YaaH) protein is an N-acetylglucosaminidase involved in spore cortex depolymerization. J Bacteriol. 190, 7601-7607 (2008).
- Wang, S., Shen, A., Setlow, P., Li, Y. Q. Characterization of the Dynamic Germination of Individual Clostridium difficile Spores Using Raman Spectroscopy and Differential Interference Contrast Microscopy. J Bacteriol. 197, 2361-2373 (2015).
