كشف اللحاء شظايا خلال البكتيرية سبور الإنبات
Summary
Herein, we describe a colorimetric assay to detect the presence of reducing sugars during bacterial spore germination.
Abstract
The process of endospore germination in Clostridium difficile, and other Clostridia, increasingly is being found to differ from the model spore-forming bacterium, Bacillus subtilis. Germination is triggered by small molecule germinants and occurs without the need for macromolecular synthesis. Though differences exist between the mechanisms of spore germination in species of Bacillus and Clostridium, a common requirement is the hydrolysis of the peptidoglycan-like cortex which allows the spore core to swell and rehydrate. After rehydration, metabolism can begin and this, eventually, leads to outgrowth of a vegetative cell. The detection of hydrolyzed cortex fragments during spore germination can be difficult and the modifications to the previously described assays can be confusing or difficult to reproduce. Thus, based on our recent report using this assay, we detail a step-by-step protocol for the colorimetric detection of cortex fragments during bacterial spore germination.
Introduction
الأبواغ هي عملية الأيض أشكال نائمة من البكتيريا التي تسمح للبكتيريا ان تستمر في البيئات غير المواتية. في كثير من البكتيريا المكونة للبوغ، هو فعل تشكيل بوغ بالحرمان من المغذيات ولكن يمكن التحكم في هذه العملية من خلال التغييرات في درجة الحموضة، والتعرض للأكسجين أو ضغوط أخرى 1. بينما في شكل بوغ نائمة عملية الأيض، والبكتيريا تقاوم الأشعة فوق البنفسجية، جفاف، ارتفاع درجات الحرارة، وتجميد 2. معظم المعارف على عملية تكاثر يأتي من دراسات في الكائن الحي نموذج، العصوية الرقيقة. تبدأ عملية تبوغ مع تكرار الحمض النووي وتشكيل 3،4 خيوط المحوري. والحاجز غير المتماثلة ثم يقسم الخلية إلى قسمين الحجم غير متكافئ. مقصورة أكبر، الخلية الأم، يجتاح حجرة صغيرة، وforespore. كل من الخلية الأم وforespore تنسيق التعبير الجيني لانضاج الجراثيم والخلية الأم انحلال في نهاية المطاف، والإفراج عن دورمانر بوغ في البيئة المحيطة 1.
يتم حفظها هيكل الجراثيم والتكوين عبر العديد من الأنواع البكتيرية. جوهر بوغ يحتوي على نسبة الماء أقل من الخلية النباتية وغنية بحمض dipicolinic (د ب أ) 1،2. خلال تشكيل بوغ، يتم ضخ DPA في صلب بوغ في مقابل الماء. المحيطة الأساسية هو غشاء بوغ الداخلي حيث، في معظم البكتيريا بوغ تشكيل، والمستقبلات التي تعترف الجزيئات الصغيرة التي تحفز إنبات (germinants) تقع 2. يقع خارج الغشاء الداخلي للبوغ هو طبقة من ببتيدوغليكان جدار الخلية. وهناك طبقة ببتيدوغليكان المتخصصة (القشرة) تحيط ببتيدوغليكان جدار الخلية وتتكون من العديد من نفس المكونات كما ببتيدوغليكان جدار الخلية [بالتناوب N-اسيتيل (ناغ) وحمض N-acetylmuramic (NAM)]. ومع ذلك، فقد تم تحويل ما يقرب من 50٪ من بقايا حركة عدم الانحياز في القشرة لالموراميك-δ لاكتام 5،6 </sتصل>. خلال إنبات الجراثيم، يتم التعرف على هذه المخلفات الموراميك-δ لاكتام من قبل بوغ قشرة الانزيمات التحللي (SCLEs)، مما يسمح للقشرة إلى أن يتحلل (وهي عملية ضرورية لإتمام الإنبات) ولكن ليس جدار الخلية. المحيطة القشرة هو الغشاء الخارجي وعدة طبقات من البروتينات معطف 2.
السيطرة على عملية الإنبات أمرا شديد الأهمية للبكتيريا تشكيل بوغ. يبدأ الإنبات عندما تتفاعل مستقبلات germinant مع germinants كل فيما يخصه 2. في كثير من البكتيريا المكونة للبوغ، هذه germinants هي الأحماض الأمينية والسكريات، النيوكليوتيدات، أيونات أو خليط منها 2. C. يبدأ صعب بوغ إنبات عن طريق مزيج من بعض أنواع الحوامض الصفراء، [على سبيل المثال، حمض taurocholic (TA)] والأحماض الأمينية (على سبيل المثال، الجلايسين) 7-10. على الرغم من وجود اختلافات بين C. العسيرة مسار الإنبات ومسارات درس في البعض تشكيل بوغالبكتيريا، مثل B. الرقيقة، مشتركة بين جميع هو شرط مطلق للحط من القشرة بوغ للسماح للخلية النباتية لتنمو من بذرة نبتت 2،8. تدهور القشرة يمكن أن يتحقق من قبل SCLEs CwlJ / SleB (كما هو موجود في B. الرقيقة) أو SleC (كما هو موجود في كثير من المطثيات). قشرة المائي يقلل من القيود على جدار الخلية والجراثيم. وهذا يسمح لمعالجة الجفاف الأساسية كاملة، خطوة ضرورية في تنشيط العديد من البروتينات اللازمة لعمليات أيض الخلايا 2.
عندما تنبت الجراثيم، والتغيرات بوغ نائمة من دولة مرحلة مشرقة لدولة مرحلة مظلمة وهذه العملية يمكن قياس التغير في الكثافة الضوئية (OD) في 600 نانومتر 11. ويشير التقرير السابق أن جزءا كبيرا من هذا التغيير في التطوير التنظيمي ويرجع ذلك إلى الإفراج عن DPA من بوغ 12. خلال دراستنا الأخيرة، سعينا لمقارنة توقيت C. صعب بوغ الإنبات ومراقبةالافراج عن الشؤون السياسية والقشرة شظايا 9. لهذه الدراسة انه من الضروري مراقبة الإفراج عن شظايا القشرة لأنها بدأت سيصدر من قبل الإنبات جراثيم.
واستند الفحص اللونية المستخدمة هنا على طريقة للكشف عن السكريات مع الحد من الغايات وضعت Ghuysen وآخرون. 13. لأن الآخرين قد وصف بروتوكولات للكشف عن السكريات المختزلة 14 أو عدلت هذه البروتوكولات 15، والأدب حول هذا الموضوع يمكن أن يكون مربكا. هنا، ونحن بالتفصيل طريقة خطوة بخطوة للكشف اللونية من السكريات المختزلة تتحرر من الإنبات C. جراثيم صعب. على الرغم من يستخدم هذه الدراسة C. جراثيم صعب، والسكريات المختزلة صدر خلال إنبات الجراثيم من البكتيريا الأخرى لتشكيل بوغ هي قادرة على أن الكشف عن هذا البروتوكول 9،16،17.
Protocol
Representative Results
Discussion
على التحفيز، الجراثيم التي تمر بعملية الإنبات تفقد خصائص مقاومة من دون الحاجة إلى تركيب الجزيئات. عندما يتم تشغيل إنبات الجراثيم، جوهر بوغ النشرات DPA مقابل الماء 2. نظرا لما يحتويه DPA عالية من الجراثيم نائمة، جوهر بوغ تحت الضغط الاسموزي الشديد وببتيدوغليكان الم…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ويدعم المشروع التي وصفها جائزة عدد 5R01AI116895 من المعهد الوطني للحساسية والأمراض المعدية. المحتوى هو فقط من مسؤولية الكتاب ولا تمثل بالضرورة وجهة النظر الرسمية للمعهد الوطني للحساسية والأمراض المعدية أو المعاهد الوطنية للصحة.
Materials
| 2.0 mL screw cap tube | USA scientific | 1420-3700 | |
| p1000 eppendorf pippet | Eppendorf | ||
| p200 eppendorf pippet | Eppendorf | ||
| p20 eppendorf pippet | Eppendorf | ||
| 100-1250uL pipet tips | VWR | 89079-486 | |
| 1-200uL pipet tips | VWR | 89079-458 | |
| N-acetyl-D-glucosamine | Sigma | A3286-25G | |
| Hydrochloric Acid – 10N | BDH-Aristar | BDH3032-3.8LP | |
| Acetic Anhydride | Alfa Aesar | L04295 | |
| Sodium Bicarbonate | BDH | BDH0280-500G | |
| Potassium Tetraborate tetrahydrate | Alfa Aesar | 39435 | |
| Sodium Hydroxide | BDH | BDH8019-500G | |
| 4-(Dimethylamino)benzaldehyde | Sigma | 156477-100G | |
| Saturated Phenol | Fisher | BP1750-400 | |
| 2-Mercaptoethanol | Aldrich | M6250-100ML | |
| SpectraMax M3 | Molecular Devices | ||
| Acetic Acid, Glacial | BDH | BDH3098-3.8LP | |
| Heated, Circulating Water Bath | VWR Scientific | Model 1136 | |
| Microtest 96 | Falcon | 353072 | 96 well clear tissue culture plates |
| Culture tubes | VWR | 89000-506 | |
| Lyophilizer | |||
| Heat Blocks | |||
| Vortex Machine | |||
References
- Al-Hinai, M. A., Jones, S. W., Papoutsakis, E. T. The Clostridium sporulation programs: diversity and preservation of endospore differentiation. Microbiol Mol Biol Rev. 79, 19-37 (2015).
- Setlow, P. Germination of spores of Bacillus species: what we know and do not know. J Bacteriol. 196, 1297-1305 (2014).
- Tan, I. S., Ramamurthi, K. S. Spore formation in Bacillus subtilis. Environ Microbiol Rep. 6, 212-225 (2014).
- Fimlaid, K. A., Shen, A. Diverse mechanisms regulate sporulation sigma factor activity in the Firmicutes. Curr Opin Microbiol. 24, 88-95 (2015).
- Popham, D. L., Helin, J., Costello, C. E., Setlow, P. Analysis of the peptidoglycan structure of Bacillus subtilis endospores. J Bacteriol. 178, 6451-6458 (1996).
- Atrih, A., Zollner, P., Allmaier, G., Foster, S. J. Structural analysis of Bacillus subtilis 168 endospore peptidoglycan and its role during differentiation. J Bacteriol. 178, 6173-6183 (1996).
- Sorg, J. A., Sonenshein, A. L. Bile salts and glycine as cogerminants for Clostridium difficile spores. J. Bacteriol. 190, 2505-2512 (2008).
- Paredes-Sabja, D., Shen, A., Sorg, J. A. Clostridium difficile spore biology: sporulation, germination, and spore structural proteins. Trends Microbiol. 22 (7), (2014).
- Francis, M. B., Allen, C. A., Sorg, J. A. Spore cortex hydrolysis precedes DPA release during Clostridium difficile spore germination. J Bacteriol. 197 (14), (2015).
- Francis, M. B., Allen, C. A., Shrestha, R., Sorg, J. A. Bile acid recognition by the Clostridium difficile Germinant Receptor, CspC, is important for establishing infection. PLoS Pathog. 9, e1003356 (2013).
- Moir, A., Smith, D. A. The Genetics of bacterial spore germination. Annu. Rev. Microbiol. 44, 531-553 (1990).
- Zhang, P., Kong, L., Wang, G., Setlow, P., Li, Y. Q. Combination of Raman tweezers and quantitative differential interference contrast microscopy for measurement of dynamics and heterogeneity during the germination of individual bacterial spores. Journal of biomedical optics. 15, 056010 (2010).
- Ghuysen, J. -. M., Tipper, D. J., Strominger, J. L. Enzymes that degrade bacterial cell walls. Methods Enzymol. 8, 685-699 (1966).
- Park, J. T., Johnson, M. J. A submicrodetermination of glucose. J Biol Chem. 181, 149-151 (1949).
- Thompson, J. S., Shockman, G. D. A modification of the Park and Johnson reducing sugar determination suitable for the assay of insoluble materials: its application to bacterial cell walls. Anal Biochem. 22, 260-268 (1968).
- Paredes-Sabja, D., Setlow, P., Sarker, M. R. SleC is essential for cortex peptidoglycan hydrolysis during germination of spores of the pathogenic bacterium Clostridium perfringens. J Bacteriol. 191, 2711-2720 (2009).
- Paredes-Sabja, D., Sarker, M. R. Effect of the cortex-lytic enzyme SleC from non-food-borne Clostridium perfringens on the germination properties of SleC-lacking spores of a food poisoning isolate. Can J Microbiol. 56, 952-958 (2010).
- Hindle, A. A., Hall, E. A. Dipicolinic acid (DPA) assay revisited and appraised for spore detection. The Analyst. 124, 1599-1604 (1999).
- Kort, R., et al. Assessment of heat resistance of bacterial spores from food product isolates by fluorescence monitoring of dipicolinic acid release. Appl Environ Microbiol. 71, 3556-3564 (2005).
- Elson, L. A., Morgan, W. T. A colorimetric method for the determination of glucosamine and chondrosamine. The Biochemical journal. 27, 1824-1828 (1933).
- Ramirez, N., Abel-Santos, E. Requirements for germination of Clostridium sordellii spores in vitro. J. Bacteriol. 192, 418-425 (2010).
- Akoachere, M., et al. Indentification of an in vivo inhibitor of Bacillus anthracis spore germination. J. Biol. Chem. 282, 12112-12118 (2007).
- Duncan, C. L., Strong, D. H. Improved medium for sporulation of Clostridium perfringens. Appl Microbiol. 16, 82-89 (1968).
- Heffron, J. D., Lambert, E. A., Sherry, N., Popham, D. L. Contributions of four cortex lytic enzymes to germination of Bacillus anthracis spores. J Bacteriol. 192, 763-770 (2010).
- Meador-Parton, J., Popham, D. L. Structural analysis of Bacillus subtilis spore peptidoglycan during sporulation. J Bacteriol. 182, 4491-4499 (2000).
- Lambert, E. A., Popham, D. L. The Bacillus anthracis SleL (YaaH) protein is an N-acetylglucosaminidase involved in spore cortex depolymerization. J Bacteriol. 190, 7601-7607 (2008).
- Wang, S., Shen, A., Setlow, P., Li, Y. Q. Characterization of the Dynamic Germination of Individual Clostridium difficile Spores Using Raman Spectroscopy and Differential Interference Contrast Microscopy. J Bacteriol. 197, 2361-2373 (2015).
