Summary

Enzyme- ואת הסרום ללא דגם תרבית תאי גזע עצבי לחקירות EMT המתאימים גילוי תרופות

Published: August 23, 2016
doi:

Summary

Epithelial to mesenchymal transition (EMT) allows cancers to become invasive. To investigate EMT, a neural stem cell (NSC)-based in vitro model devoid of serum and enzymes is described. This standardized system allows quantitative and qualitative assessment of cell migration, gene and protein expression. The model is suited for drug discovery.

Abstract

אפיתל המעבר mesenchymal (EMT) מתאר את התהליך של האפיתל transdifferentiating לתוך mesenchyme. EMT הוא תהליך בסיסי במהלך ההתפתחות העוברית כי גם מופיע לרוב גליובלסטומה, שסבלה מגידול ממאיר במוח השכיח ביותר. EMT גם נצפה קרצינומות מרובות מחוץ למוח כולל סרטן השד, סרטן הריאות, סרטן המעי גס, סרטן קיבה. EMT קשורה מרכזי לממאירות באמצעות קידום הגירה, הפלישה והיווצרות גרורות. המנגנונים של אינדוקציה EMT אינם מובנים במלואם. כאן אנו מתארים מערכת במבחנה לבידוד סטנדרטי של תאי גזע עצביים בקליפת מוח (NSCs) ו EMT-האינדוקציה הבאה. מערכת זו מספקת את הגמישות להשתמש גם תאים בודדים או תרבות explant. במערכת זו, חולדה או עכבר עובריים NSCs המוח הקדמי מתורבתים בתווך מוגדר, נטול בסרום ואנזימים. NSCs הביע Olig2 ו Sox10, שני גורמי שעתוק שנצפתה oligodendrocתאי מבשר YTE (OPCs). באמצעות מערכת זו, אינטראקציות בין FGF-, BMP- ו TGFβ-איתות מעורבים Zeb1, Zeb2, ו Twist2 נצפו שם TGFβ הפעלה משופרת באופן משמעותי נדידת תאים, דבר המצביע על BMP- / TGFβ אינטראקציה סינרגיסטית. התוצאות מצביעות על רשת של FGF-, BMP- ו TGFβ-איתות להיות מעורב אינדוקציה ותחזוקה EMT. מערכת מודל זה רלוונטי לחקור EMT במבחנה. זה וחסכוני ומראה שחזור גבוה. זה גם מאפשר את ההשוואה של תרכובות שונות ביחס לתגובות ההגירה שלהם (מדידת מרחק כמותי), והקרנת תפוקה גבוהה של תרכובות כדי לעכב או לשפר EMT (מדידה איכותית). המודל ולכן גם מתאים לבחון ספריות תרופה עבור חומרים המשפיעים EMT.

Introduction

במהלך מספר שלבים של התפתחות עוברית, תאי אפיתל לאבד הדבקות החזקה שלהם זה לזה (למשל, צומת הדוקים) ולרכוש פנוטיפ נודדת בתוך אפיתל תהליך שנקרא מעבר mesenchymal (EMT) 1. EMT נדרש להקמת סוגי תאים נוספים, כגון תאי הרכס העצבי mesenchymal, אוכלוסייה מבדלת מן neuroepithelium 2. EMT אינה הכרחית רק בשלבים עובריים אלא גם נדרש בשלבים מאוחרים יותר של החיים הבוגרים לקיים תהליכים פיזיולוגיים באורגניזם בוגר, כגון ריפוי פצעים 3 ומערכת העצבים המרכזית (CNS) התחדשות demyelinating נגעים 4.

גידולים אפיתל ידועים מחדש EMT כצעד חניכה הגירה, הפלישה גרורות, בסופו של דבר שמוביל להתפתחות הסרטן 1,3. EMT אכן קשור מרכזי כדי 1,3 הגירה חזקה. השלבים הסלולר של גonditioning, ייזום, עובר ושמירת EMT אינו מובנה במלוא וצריך לחקירה נוספת.

כאן, מערכת מודל EMT סטנדרטית במבחנה המבוססת על NSCs, עם גורמי גדילה מוגדרות ומדיה (לא בסרום ולא שימוש אנזים) מוצגת. מערכת מודל זה של רלוונטי עבור מדענים עובדים על EMT. משפחות חלבון החילזון, זב טוויסט הוכחו להיות קריטי עבור EMT הוא בפיתוח ומחלות 1. החילזון, משפחות זב טוויסט מעורבים גם במערכת הציג. המערכת מבוססת על אזור מסוים של המוח הקדמי שבדרך כלל אינו עובר מתן EMT יתרון מסוים לחקר אירועים ראשוניים במהלך אינדוקצית EMT.

מערכת המודל ניתן להחילו ללמוד EMT ב epithelia מחוץ CNS, מאז מעוררים EMT מפתח, כגון חילזון, זב וחלבונים טוויסט, מצויים גם במהלך EMT במערכות רקמות מחוץ למערכת העצבים המרכזית. במודל זהystem מאפשר בידוד סטנדרטי של NSCs מהקורטקס בפיתוח ללמוד תכונות תאי גזע בכלל EMT בפרט. באמצעות מערכת זו, אנו מבודדים EMT NSCs, מושרה ולומדים הגירה שלאחר מכן תחת השפעת FGF2 ו BMP4. הבחנו כי FGF- ו- BMP-איתות אינטראקציה עם TGFβ-איתות לקדם נדידת תאים, ובכך אימות מערכת מודל.

Protocol

הנהלים כל חיה בעקבות 'מדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה "(פרסום NIH, 8 המהדורה ה 2011) ואושרו על ידי ועדת צער בעלי חיים של באזל (הנחיות שוויצרי עבור טיפול ושימוש בחיות). בהנחיות אלה פרוטוקול החיה נחשב של "דרגת חומרת החיה הנמוכה ביותר". 1…

Representative Results

מערכת מודל EMT זה מבוסס על בידוד סטנדרטי של NSCs הן תאים בודדים או כמו explants מאזור מסוים של הצינור העצבי בפיתוח, הקורטקס (איורים 1 ו -2). לקבלת הערכה כמותית, explants היו זורעים ממש במרכז של צלחת תרבות הרשת 500 מיקרומטר (איור 3). Explants מהק?…

Discussion

במחקר זה מערכת סטנדרטית עבור NSCs ניצול ניתוח EMT מתואר (שהעיקריים בהם פורטו משלים איור 3). הסטנדרטיזציה מבטיח שחזור (טבלה 1 ו -2). NSCs נגזרת הקליפה בפיתוח, רקמה שבדרך כלל אינו עוברת EMT. זהו יתרון לניתוח צעדים מוקדם EMT. צעדים ראשוניים EMT לא ניתן ללמוד כראוי בתא…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

המחקר נתמך על ידי האוניברסיטה של ​​הקרן הלאומית למדע באזל ואת השוויצרי הקרן הלאומית למדע ידי מענק MHS ו AG (SNF IZLIZ3_157230). אנו מודים: ד"ר טניה רינלדי Burkat למתן תשתית בנדיבות; כל חברי הקבוצה Bettler לדיונים והערות. אנו מודים גרהרד Dorne (Leica Microsystems, שוויץ) עבור התקנה מקצועית המוסמכת של מצלמת וידאו HD MC170 המלאה (Leica Microsystems, שוויץ).

Materials

BMP4, rhBMP4 RnD Systems  314-BP-01M
Bovine pancreas insulin Sigma  I1882
Boyden chamber, CytoSelect cell invasion assay Cell Biolabs CBA-110 24 well plate system
Cell culture dish with grid Ibidi 500 mm dish, 35 mm 80156
CellMask Orange Life Technologies C10045 Plasma membrane dye, use at 1:1000 .
DAPI LifeTechnologies D1306 Stock at 5mg/ml. Use at 1:10000. Cancerogenic. Appropriate protection (gloves, coat, goggles) required.
DMEM/F12 1:1 medium bottle Gibco Invitrogen 21331-020
FGF2, rhFGF2 RnD Systems 233-FB-01M
Fibronectine, bovine Sigma  F4759
Glutamax supplement  Gibco Invitrogen  35050-061
Graphics software with pixel measurement feature Fiji fiji.sc/Fiji version 2.0.0-rc-30/1.49s
HBSS media Sigma  H9394
Human apo-Transferrin Sigma T1147 Possible lung irritant. Avoid inhalation. Use appropriate protection.
L-glutamine Gibco Invitrogen  25030-024
Nestin, Mouse anti Nestin antibody Genetex GTX26142 Use at 1:100, 4% PFA fixation, Triton X100 at 0.1%
Olig2, Rabbit anti Olig2 antibody Provided by Hirohide Takebayash Personal stock Use at 1:2000, 4% PFA fixation, Triton X100 at 0.1%
Penicillin/Streptomycin/Fungizone Gibco Invitrogen  15240-062
Podoplanin, Mouse anti Podoplanin antibody Acris DM3614P Use at 1:250, 4% PFA fixation, avoid Triton X100
Poly-L-ornithine Sigma  P3655
Putrescine Sigma  P5780 Skin and eye irritant. Appropriate protection required.
Sodium selenite Sigma  S5261
Sox10, Rabbit anti Sox10 antibody Millipore Chemicon AB5774 Use at 1:200, 4% PFA fixation, Triton X100 at 0.1%
TGFb1, rhTGFb1 RnD Systems 240-B-010
Uncoated Petri dishes Falcon Corning 351029

References

  1. Nieto, M. A. Epithelial-Mesenchymal Transitions in development and disease: old views and new perspectives. Int J Dev Biol. 53, 1541-1547 (2009).
  2. Sauka-Spengler, T., Bronner-Fraser, M. A gene regulatory network orchestrates neural crest formation. Nat Rev Mol Cell Biol. 9, 557-568 (2008).
  3. Barriere, G., Fici, P., Gallerani, G., Rigaud, M. Mesenchymal Transition: a double-edged sword. Clin Transl Med. 4, 14 (2015).
  4. Zawadzka, M., et al. CNS-resident glial progenitor/stem cells produce Schwann cells as well as oligodendrocytes during repair of CNS demyelination. Cell Stem Cell. 6, 578-590 (2010).
  5. Paxinos, G., Ashwell, K. W. S., Törk, I. . Atlas of the developing rat nervous system. , (1994).
  6. O’Leary, D. D., Chou, S. J., Sahara, S. Area patterning of the mammalian cortex. Neuron. 56, 252-269 (2007).
  7. O’Leary, D. D., Sahara, S. Genetic regulation of arealization of the neocortex. Curr Opin Neurobiol. 18, 90-100 (2008).
  8. Sailer, M. H., et al. Non-invasive neural stem cells become invasive in vitro by combined FGF2 and BMP4 signaling. J Cell Sci. 126, 3533-3540 (2013).
  9. Sailer, M. H., et al. BMP2 and FGF2 cooperate to induce neural-crest-like fates from fetal and adult CNS stem cells. J Cell Sci. 118, 5849-5860 (2005).
  10. Sailer, M., Oppitz, M., Drews, U. Induction of cellular contractions in the human melanoma cell line SK-mel 28 after muscarinic cholinergic stimulation. Anat Embryol (Berl). 201, 27-37 (2000).
  11. Wicki, A., Christofori, G. The potential role of podoplanin in tumour invasion. Br J Cancer. 96, 1-5 (2007).
  12. Wicki, A., et al. Tumor invasion in the absence of epithelial-mesenchymal transition: podoplanin-mediated remodeling of the actin cytoskeleton. Cancer Cell. 9, 261-272 (2006).
  13. Mishima, K., et al. Increased expression of podoplanin in malignant astrocytic tumors as a novel molecular marker of malignant progression. Acta Neuropathol. 111, 483-488 (2006).
  14. Motomura, K., et al. Immunohistochemical analysis-based proteomic subclassification of newly diagnosed glioblastomas. Cancer Science. 103, 1871-1879 (2012).
  15. Kono, T., et al. Immunohistochemical detection of the lymphatic marker podoplanin in diverse types of human cancer cells using a novel antibody. Int J Oncol. 31, 501-508 (2007).
  16. Raica, M., Cimpean, A. M., Ribatti, D. The role of podoplanin in tumor progression and metastasis. Anticancer Res. 28, 2997-3006 (2008).
  17. Panchision, D. M., McKay, R. D. The control of neural stem cells by morphogenic signals. Curr Opin Genet Dev. 12, 478-487 (2002).
  18. Lamouille, S., Xu, J., Derynck, R. Molecular mechanisms of epithelial-mesenchymal transition. Nat Rev Mol Cell Biol. 15, 178-196 (2014).
  19. Gonzalez-Perez, O., Alvarez-Buylla, A. Oligodendrogenesis in the subventricular zone and the role of epidermal growth factor. Brain Res Rev. 67, 147-156 (2011).
  20. Hu, J. G., et al. PDGF-AA mediates B104CM-induced oligodendrocyte precursor cell differentiation of embryonic neural stem cells through Erk, PI3K, and p38 signaling. J Mol Neurosci. 46, 644-653 (2012).
  21. Galvao, R. P., et al. Transformation of quiescent adult oligodendrocyte precursor cells into malignant glioma through a multistep reactivation process. Proc Natl Acad Sci U S A. 111, E4214-E4223 (2014).
  22. Liu, C., et al. Mosaic analysis with double markers reveals tumor cell of origin in glioma. Cell. 146, 209-221 (2011).
  23. Das, S., Srikanth, M., Kessler, J. A. Cancer stem cells and glioma. Nat Clin Pract Neurol. 4, 427-435 (2008).
  24. Modrek, A. S., Bayin, N. S., Placantonakis, D. G. Brain stem cells as the cell of origin in glioma. World J Stem Cells. 6, 43-52 (2014).
  25. Sampetrean, O., et al. Invasion precedes tumor mass formation in a malignant brain tumor model of genetically modified neural stem cells. Neoplasia. 13, 784-791 (2011).
  26. McNeill, R. S., et al. Modeling astrocytoma pathogenesis in vitro and in vivo using cortical astrocytes or neural stem cells from conditional, genetically engineered mice. JoVE. , e51763 (2014).
  27. Lara-Padilla, E., Caceres-Cortes, J. R. On the nature of the tumor-initiating cell. Curr Stem Cell Res Ther. 7, 26-35 (2012).
  28. Busch, C., et al. BMP-2-dependent integration of adult mouse subventricular stem cells into the neural crest of chick and quail embryos. J Cell Sci. 119, 4467-4474 (2006).
  29. Thiery, J. P., Acloque, H., Huang, R. Y., Nieto, M. A. Epithelial-mesenchymal transitions in development and disease. Cell. 139, 871-890 (2009).
  30. McDonald, O. G., Wu, H., Timp, W., Doi, A., Feinberg, A. P. Genome-scale epigenetic reprogramming during epithelial-to-mesenchymal transition. Nat Struct Mol Biol. 18, 867-874 (2011).
  31. Rahimi, R. A., Leof, E. B. TGF-beta signaling: a tale of two responses. J Cell Biochem. 102, 593-608 (2007).
  32. Xu, J., Lamouille, S., Derynck, R. TGF-beta-induced epithelial to mesenchymal transition. Cell Res. 19, 156-172 (2009).
  33. Suva, M. L., Riggi, N., Bernstein, B. E. Epigenetic reprogramming in cancer. Science. 339, 1567-1570 (2013).
  34. Sullivan, R., et al. A possible new focus for stroke treatment – migrating stem cells. Expert Opin Biol Ther. , 1-10 (2015).

Play Video

Cite This Article
Sailer, M. H. M., Sarvepalli, D., Brégère, C., Fisch, U., Guentchev, M., Weller, M., Guzman, R., Bettler, B., Ghosh, A., Hutter, G. An Enzyme- and Serum-free Neural Stem Cell Culture Model for EMT Investigation Suited for Drug Discovery. J. Vis. Exp. (114), e54018, doi:10.3791/54018 (2016).

View Video