Ilaç keşfi için uygundur EMT araştırma için enzim ve serum içermeyen nöral kök hücre kültürü modeli
Summary
Epithelial to mesenchymal transition (EMT) allows cancers to become invasive. To investigate EMT, a neural stem cell (NSC)-based in vitro model devoid of serum and enzymes is described. This standardized system allows quantitative and qualitative assessment of cell migration, gene and protein expression. The model is suited for drug discovery.
Abstract
mezenkimal geçiş (EMT) için epitel epitel mezenşimin içine transdifferentiating işlemi anlatılmaktadır. EMT da yaygın, glioblastoma en sık malign beyin tümörü meydana embriyonik gelişim sırasında temel bir süreçtir. EMT, aynı zamanda, göğüs kanseri, akciğer kanseri, kolon kanseri, mide kanseri de dahil olmak üzere beyin dışında çok karsinom gözlenmiştir. EMT merkezi göç, işgali ve metastaz oluşumunu teşvik ederek malignite bağlantılıdır. EMT indüksiyon mekanizmaları tam olarak anlaşılmış değildir. Burada kortikal nöral kök hücre (NSC'lerde) ve daha sonra EMT indüksiyonu standart izolasyonu için in vitro bir sistem tarif eder. Bu sistem tek hücreler veya eksplant kültürü ya da kullanmak için esneklik sağlar. Bu sistemde, sıçan veya fare embriyonik ön beyin NSC'lerde, tanımlanmış bir ortam içinde kültürlenmiş ve serum enzimlerin yoksundur. NSC'lerde oligodendrositlerin gözlenen olig2 ve Sox10 iki transkripsiyon faktörleri olarak ifadeYTE ön-madde hücreleri (OPC). Bu sistemi kullanarak, FGF-, BMP- arasındaki etkileşimler Zeb1, Zeb2 içeren TGFβ-sinyal ve Twist2 TGFβ etkinleştirme önemli ölçüde sinerjistik BMP- / TGFβ-etkileşim olduğunu, hücre göçü geliştirilmiş burada gözlenmiştir. Sonuçlar EMT indüksiyonu ve bakım dahil olmak FGF-, BMP- ve TGFβ-sinyal ağı işaret eder. Bu model sistemi, in vitro EMT araştırmak için uygundur. Bu düşük maliyetli ve yüksek tekrarlanabilirlik göstermektedir. Ayrıca, göç yanıtlara göre (kantitatif mesafe ölçümü) ve inhibe etmek veya EMT (kalitatif ölçümü) geliştirmek için bileşikler yüksek verimli tarama ile farklı bileşiklerin karşılaştırılmasına imkan verir. modeli bu nedenle de EMT etkileyen maddeler için ilaç kütüphaneleri test etmek için uygundur.
Introduction
Embriyonik gelişme birkaç aşamalarında, epitel hücreleri birbirine (örneğin, sıkı kavşaklar) için güçlü bağlılığı kaybeder ve mezenkimal geçiş (EMT) 1 bir süreç olarak adlandırılan epitel bir göçmen fenotip kazanır. EMT gibi mezenkimal nöral tepe hücreleri gibi ek hücre tiplerinin oluşumu neuroepithelium 2 ayıran bir popülasyon için gereklidir. EMT evrelerinde sadece gerekli değil, aynı zamanda lezyonlar 4 demiyelinizan böyle yara iyileşmesi 3 ve merkezi sinir sistemi (MSS) rejenerasyon olarak yetişkin organizmada fizyolojik süreçleri, korumak için yetişkin hayatının ileriki aşamalarında gerekli değildir.
Epitelyal tümörler sonuçta kanser oluşumunu 1,3 giden, göç, istila ve metastaz için bir başlangıç adımı olarak EMT yeniden bilinmektedir. EMT gerçekten merkezi güçlü göç 1,3 bağlantılıdır. c hücresel adımlarıonditioning, başlatılması geçiren ve EMT sürdürmek tam olarak anlaşılamamıştır ve daha fazla araştırma ihtiyaç değildir.
Burada tanımlanan büyüme faktörleri ve ortam (hiç serum ve enzim) kullanılmasına NSC'lerde göre standart bir in vitro EMT model sistem sunulmuştur. Bu model sistem EMT üzerinde çalışan bilim adamları için öneme sahiptir. Salyangoz, Zeb ve büküm protein aileleri Geliştirme ve hastalık 1 EMT için kritik olduğu gösterilmiştir. Salyangoz, Zeb ve Büküm aileler de sunulan sistemde yer almaktadır. Sistem normal EMT EMT indüksiyon sırasında ilk olayların incelenmesi için özel bir avantaj sağlayarak uğramayan önbeyin belirli bir bölgeye dayanmaktadır.
Bu Salyangoz, Zeb ve büküm proteinleri gibi önemli EMT indükleyiciler, aynı zamanda merkezi sinir sistemi dışındaki doku sistemleri EMT sırasında bulunan yana model sistem, potansiyel olarak, merkezi sinir sistemi dışındaki epitelde EMT çalışma uygulanabilir. Bu model sistem, özellikle, kök hücre, genel olarak özellikleri ve EMT çalışma gelişmekte korteksten NSC'lerde standart izolasyon sağlar. Bu sistemi kullanarak, biz, NSC'lerde izole kaynaklı EMT ve FGF2'deki ve BMP4 etkisindeki sonraki göç okudu. Biz FGF- ve böylece model sistem doğrulayarak, hücre göçü teşvik etmek TGFβ-sinyal ile etkileşime BMP-sinyalizasyon görülmektedir.
Protocol
Representative Results
Discussion
EMT analizi kullanan NSC'lerde için standart bir sistem tarif edilmektedir Bu çalışmada, (Ek Şekil 3'te özetlenmiştir). Standardizasyon tekrarlanabilirliği (Tablo 1 ve 2) sağlamaktadır. NSC'lerde gelişmekte korteksinden normal EMT uğramayan bir doku elde edilir. Bu EMT erken aşamada analizi için avantajlıdır. EMT içinde ilk adımlar yeterli genetik değişiklikler birikmiş ve zaten EMT özelliklerini benimsemiş olabilir tümör hücrelerinde okudu edilemez…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Çalışma MHS ve AG (SNF IZLIZ3_157230) bir hibe ile Basel Bilim Vakfı Üniversitesi ve İsviçre Ulusal Bilim Vakfı tarafından desteklenmiştir. Biz teşekkür ederiz: Dr. Tania Rinaldi Burkat cömertçe altyapının sağlanması için; tartışmalar ve yorumlar için Bettler grubun tüm üyeleri. Biz Gerhard Dorne (Leica Microsystems, İsviçre) Full HD MC170 video kamera profesyonel ve yetkin montaj için (Leica Microsystems, İsviçre) teşekkür ederim.
Materials
| BMP4, rhBMP4 | RnD Systems | 314-BP-01M | |
| Bovine pancreas insulin | Sigma | I1882 | |
| Boyden chamber, CytoSelect cell invasion assay | Cell Biolabs | CBA-110 | 24 well plate system |
| Cell culture dish with grid | Ibidi 500 mm dish, 35 mm | 80156 | |
| CellMask Orange | Life Technologies | C10045 | Plasma membrane dye, use at 1:1000 . |
| DAPI | LifeTechnologies | D1306 | Stock at 5mg/ml. Use at 1:10000. Cancerogenic. Appropriate protection (gloves, coat, goggles) required. |
| DMEM/F12 1:1 medium bottle | Gibco Invitrogen | 21331-020 | |
| FGF2, rhFGF2 | RnD Systems | 233-FB-01M | |
| Fibronectine, bovine | Sigma | F4759 | |
| Glutamax supplement | Gibco Invitrogen | 35050-061 | |
| Graphics software with pixel measurement feature | Fiji | fiji.sc/Fiji | version 2.0.0-rc-30/1.49s |
| HBSS media | Sigma | H9394 | |
| Human apo-Transferrin | Sigma | T1147 | Possible lung irritant. Avoid inhalation. Use appropriate protection. |
| L-glutamine | Gibco Invitrogen | 25030-024 | |
| Nestin, Mouse anti Nestin antibody | Genetex | GTX26142 | Use at 1:100, 4% PFA fixation, Triton X100 at 0.1% |
| Olig2, Rabbit anti Olig2 antibody | Provided by Hirohide Takebayash | Personal stock | Use at 1:2000, 4% PFA fixation, Triton X100 at 0.1% |
| Penicillin/Streptomycin/Fungizone | Gibco Invitrogen | 15240-062 | |
| Podoplanin, Mouse anti Podoplanin antibody | Acris | DM3614P | Use at 1:250, 4% PFA fixation, avoid Triton X100 |
| Poly-L-ornithine | Sigma | P3655 | |
| Putrescine | Sigma | P5780 | Skin and eye irritant. Appropriate protection required. |
| Sodium selenite | Sigma | S5261 | |
| Sox10, Rabbit anti Sox10 antibody | Millipore Chemicon | AB5774 | Use at 1:200, 4% PFA fixation, Triton X100 at 0.1% |
| TGFb1, rhTGFb1 | RnD Systems | 240-B-010 | |
| Uncoated Petri dishes | Falcon Corning | 351029 |
References
- Nieto, M. A. Epithelial-Mesenchymal Transitions in development and disease: old views and new perspectives. Int J Dev Biol. 53, 1541-1547 (2009).
- Sauka-Spengler, T., Bronner-Fraser, M. A gene regulatory network orchestrates neural crest formation. Nat Rev Mol Cell Biol. 9, 557-568 (2008).
- Barriere, G., Fici, P., Gallerani, G., Rigaud, M. Mesenchymal Transition: a double-edged sword. Clin Transl Med. 4, 14 (2015).
- Zawadzka, M., et al. CNS-resident glial progenitor/stem cells produce Schwann cells as well as oligodendrocytes during repair of CNS demyelination. Cell Stem Cell. 6, 578-590 (2010).
- Paxinos, G., Ashwell, K. W. S., Törk, I. . Atlas of the developing rat nervous system. , (1994).
- O’Leary, D. D., Chou, S. J., Sahara, S. Area patterning of the mammalian cortex. Neuron. 56, 252-269 (2007).
- O’Leary, D. D., Sahara, S. Genetic regulation of arealization of the neocortex. Curr Opin Neurobiol. 18, 90-100 (2008).
- Sailer, M. H., et al. Non-invasive neural stem cells become invasive in vitro by combined FGF2 and BMP4 signaling. J Cell Sci. 126, 3533-3540 (2013).
- Sailer, M. H., et al. BMP2 and FGF2 cooperate to induce neural-crest-like fates from fetal and adult CNS stem cells. J Cell Sci. 118, 5849-5860 (2005).
- Sailer, M., Oppitz, M., Drews, U. Induction of cellular contractions in the human melanoma cell line SK-mel 28 after muscarinic cholinergic stimulation. Anat Embryol (Berl). 201, 27-37 (2000).
- Wicki, A., Christofori, G. The potential role of podoplanin in tumour invasion. Br J Cancer. 96, 1-5 (2007).
- Wicki, A., et al. Tumor invasion in the absence of epithelial-mesenchymal transition: podoplanin-mediated remodeling of the actin cytoskeleton. Cancer Cell. 9, 261-272 (2006).
- Mishima, K., et al. Increased expression of podoplanin in malignant astrocytic tumors as a novel molecular marker of malignant progression. Acta Neuropathol. 111, 483-488 (2006).
- Motomura, K., et al. Immunohistochemical analysis-based proteomic subclassification of newly diagnosed glioblastomas. Cancer Science. 103, 1871-1879 (2012).
- Kono, T., et al. Immunohistochemical detection of the lymphatic marker podoplanin in diverse types of human cancer cells using a novel antibody. Int J Oncol. 31, 501-508 (2007).
- Raica, M., Cimpean, A. M., Ribatti, D. The role of podoplanin in tumor progression and metastasis. Anticancer Res. 28, 2997-3006 (2008).
- Panchision, D. M., McKay, R. D. The control of neural stem cells by morphogenic signals. Curr Opin Genet Dev. 12, 478-487 (2002).
- Lamouille, S., Xu, J., Derynck, R. Molecular mechanisms of epithelial-mesenchymal transition. Nat Rev Mol Cell Biol. 15, 178-196 (2014).
- Gonzalez-Perez, O., Alvarez-Buylla, A. Oligodendrogenesis in the subventricular zone and the role of epidermal growth factor. Brain Res Rev. 67, 147-156 (2011).
- Hu, J. G., et al. PDGF-AA mediates B104CM-induced oligodendrocyte precursor cell differentiation of embryonic neural stem cells through Erk, PI3K, and p38 signaling. J Mol Neurosci. 46, 644-653 (2012).
- Galvao, R. P., et al. Transformation of quiescent adult oligodendrocyte precursor cells into malignant glioma through a multistep reactivation process. Proc Natl Acad Sci U S A. 111, E4214-E4223 (2014).
- Liu, C., et al. Mosaic analysis with double markers reveals tumor cell of origin in glioma. Cell. 146, 209-221 (2011).
- Das, S., Srikanth, M., Kessler, J. A. Cancer stem cells and glioma. Nat Clin Pract Neurol. 4, 427-435 (2008).
- Modrek, A. S., Bayin, N. S., Placantonakis, D. G. Brain stem cells as the cell of origin in glioma. World J Stem Cells. 6, 43-52 (2014).
- Sampetrean, O., et al. Invasion precedes tumor mass formation in a malignant brain tumor model of genetically modified neural stem cells. Neoplasia. 13, 784-791 (2011).
- McNeill, R. S., et al. Modeling astrocytoma pathogenesis in vitro and in vivo using cortical astrocytes or neural stem cells from conditional, genetically engineered mice. JoVE. , e51763 (2014).
- Lara-Padilla, E., Caceres-Cortes, J. R. On the nature of the tumor-initiating cell. Curr Stem Cell Res Ther. 7, 26-35 (2012).
- Busch, C., et al. BMP-2-dependent integration of adult mouse subventricular stem cells into the neural crest of chick and quail embryos. J Cell Sci. 119, 4467-4474 (2006).
- Thiery, J. P., Acloque, H., Huang, R. Y., Nieto, M. A. Epithelial-mesenchymal transitions in development and disease. Cell. 139, 871-890 (2009).
- McDonald, O. G., Wu, H., Timp, W., Doi, A., Feinberg, A. P. Genome-scale epigenetic reprogramming during epithelial-to-mesenchymal transition. Nat Struct Mol Biol. 18, 867-874 (2011).
- Rahimi, R. A., Leof, E. B. TGF-beta signaling: a tale of two responses. J Cell Biochem. 102, 593-608 (2007).
- Xu, J., Lamouille, S., Derynck, R. TGF-beta-induced epithelial to mesenchymal transition. Cell Res. 19, 156-172 (2009).
- Suva, M. L., Riggi, N., Bernstein, B. E. Epigenetic reprogramming in cancer. Science. 339, 1567-1570 (2013).
- Sullivan, R., et al. A possible new focus for stroke treatment – migrating stem cells. Expert Opin Biol Ther. , 1-10 (2015).
