Een enzym en Serum-free neurale stamcel Cultuur Model voor EMT Investigation Geschikt voor Drug Discovery
Summary
Epithelial to mesenchymal transition (EMT) allows cancers to become invasive. To investigate EMT, a neural stem cell (NSC)-based in vitro model devoid of serum and enzymes is described. This standardized system allows quantitative and qualitative assessment of cell migration, gene and protein expression. The model is suited for drug discovery.
Abstract
Epitheliale naar mesenchymale transitie (EMT) beschrijft het proces van epitheel transdifferentiating in mesenchym. EMT is een fundamenteel proces tijdens de embryonale ontwikkeling die ook voorkomt bij glioblastoma, de meest voorkomende kwaadaardige hersentumor. EMT is ook waargenomen in meerdere carcinomen buiten de hersenen waaronder borstkanker, longkanker, darmkanker, maagkanker. EMT is centraal verbonden met maligniteit door het bevorderen migratie, invasie en metastasering. De mechanismen van EMT inductie zijn niet volledig begrepen. Hier beschrijven we een in vitro systeem voor gestandaardiseerde corticale isoleren van neurale stamcellen (NSC's) en daaropvolgende EMT-inductie. Dit biedt de flexibiliteit om hetzij enkele cellen of explantaatkweek gebruiken. In dit systeem, rat of muis embryonale voorhersenen NSC's gekweekt in een gedefinieerd medium zonder serum en enzymen. De NSCs uitgedrukt Olig2 en Sox10, twee transcriptiefactoren waargenomen in oligodendrocYTE precursorcellen (OPC). Met behulp van dit systeem, interacties tussen FGF-, BMP en TGF-signalering waarbij Zeb1, Zeb2 en Twist2 waargenomen, waar TGF-activering aanzienlijk verbeterd cel migratie, hetgeen duidt op een synergetische BMP / TGF-interactie. De resultaten wijzen op een netwerk van FGF-, BMP en TGF-signalering te worden betrokken bij EMT inductie en onderhoud. Dit modelsysteem is relevant EMT in vitro. Het is kostenefficiënt en geeft hoge reproduceerbaarheid. Het staat ook voor de vergelijking van verschillende verbindingen met betrekking tot hun migratie reacties (kwantitatief afstandsmeting) en high-throughput screening van verbindingen voor het remmen of verbeteren EMT (kwalitatieve meting). Het model is dan ook zeer geschikt voor drug bibliotheken testen voor stoffen van invloed zijn EMT.
Introduction
Gedurende verschillende stadia van embryonale ontwikkeling, epitheelcellen verliezen hun sterke hechting aan elkaar (bijv tight junctions) en het verwerven van een trekkende fenotype in een proces genaamd epitheliale naar mesenchymale transitie (EMT) 1. EMT is nodig voor de vorming van andere celtypen, zoals mesenchymale neurale cellen, een populatie die scheidt van de neuroepithelium 2. EMT is niet alleen essentieel tijdens embryonale stadia maar ook vereist in latere volwassen leven fysiologische processen in het volwassen organisme, zoals wondgenezing 3 en centraal zenuwstelsel (CNS) regeneratie handhaven demyeliniserende laesies 4.
Epitheliale tumoren is bekend dat EMT reactiveren als een initiatie stap voor de migratie, invasie en metastase, wat uiteindelijk leidt tot de progressie van kanker 1,3. EMT inderdaad centraal gekoppeld aan een sterke migratie 1,3. De cellulaire stappen conditioning, initiëren, ondergaan en onderhouden van EMT niet volledig begrepen en moet verder onderzoek.
Hier wordt een gestandaardiseerde in vitro modelsysteem EMT basis van NSC, met gedefinieerde groeifactoren en media (geen serum en geen enzym gebruik) gepresenteerd. Dit model systeem van belang is voor wetenschappers die werken aan EMT. De Slak, Zeb en Twist eiwit families is aangetoond van cruciaal belang voor EMT, zowel in ontwikkeling en ziekte 1 te zijn. De Slak, Zeb en Twist families zijn ook betrokken bij de gepresenteerde systeem. Het systeem is gebaseerd op een bepaalde regio van de voorhersenen die normaal ondergaat EMT verschaffen van een bijzonder voordeel voor de studie van begingebeurtenissen gedurende EMT inductie.
Het modelsysteem zou kunnen worden toegepast op EMT in epithelia buiten het CZS te bestuderen, aangezien belangrijke EMT inductoren, zoals de slak, en Zeb Twist eiwitten, zijn gedurende EMT in weefsel dat zich buiten het CZS. Dit model system laat de gestandaardiseerde isolatie van NSCs uit de ontwikkelingslanden cortex om stamcellen functies in het algemeen en EMT in het bijzonder te bestuderen. Met dit systeem geïsoleerde we NSC geïnduceerde EMT en bestudeerden de daaropvolgende migratie onder invloed van FGF2 en BMP4. We zagen dat FGF- en BMP-signalering interageert met TGFp-signalering naar cel migratie te bevorderen, waardoor de validatie van het model systeem.
Protocol
Representative Results
Discussion
In deze studie gestandaardiseerd systeem voor EMT analyse gebruik NSC is beschreven (samengevat in aanvullende figuur 3). De reproduceerbaarheid Standaardisatie (Tabel 1 en 2). De NSCs zijn afgeleid van de ontwikkeling cortex, een weefsel dat normaliter EMT niet ondergaat. Dit is van voordeel voor de analyse van de eerste stappen in EMT. Eerste stappen in EMT kan niet voldoende worden bestudeerd in tumorcellen die genetische veranderingen hebben opgebouwd en kunnen al EMT kenmerken vast…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De studie werd ondersteund door de Universiteit van Basel Science Foundation en de Zwitserse National Science Foundation door een subsidie aan MHS en AG (SNF IZLIZ3_157230). Wij danken: Dr. Tania Rinaldi Burkat voor royaal verstrekken van infrastructuur; alle leden van de Bettler groep voor discussies en commentaar. Wij danken Gerhard Dorne (Leica Microsystems, Zwitserland) voor de professionele en deskundige installatie van de Full HD MC170 videocamera (Leica Microsystems, Zwitserland).
Materials
| BMP4, rhBMP4 | RnD Systems | 314-BP-01M | |
| Bovine pancreas insulin | Sigma | I1882 | |
| Boyden chamber, CytoSelect cell invasion assay | Cell Biolabs | CBA-110 | 24 well plate system |
| Cell culture dish with grid | Ibidi 500 mm dish, 35 mm | 80156 | |
| CellMask Orange | Life Technologies | C10045 | Plasma membrane dye, use at 1:1000 . |
| DAPI | LifeTechnologies | D1306 | Stock at 5mg/ml. Use at 1:10000. Cancerogenic. Appropriate protection (gloves, coat, goggles) required. |
| DMEM/F12 1:1 medium bottle | Gibco Invitrogen | 21331-020 | |
| FGF2, rhFGF2 | RnD Systems | 233-FB-01M | |
| Fibronectine, bovine | Sigma | F4759 | |
| Glutamax supplement | Gibco Invitrogen | 35050-061 | |
| Graphics software with pixel measurement feature | Fiji | fiji.sc/Fiji | version 2.0.0-rc-30/1.49s |
| HBSS media | Sigma | H9394 | |
| Human apo-Transferrin | Sigma | T1147 | Possible lung irritant. Avoid inhalation. Use appropriate protection. |
| L-glutamine | Gibco Invitrogen | 25030-024 | |
| Nestin, Mouse anti Nestin antibody | Genetex | GTX26142 | Use at 1:100, 4% PFA fixation, Triton X100 at 0.1% |
| Olig2, Rabbit anti Olig2 antibody | Provided by Hirohide Takebayash | Personal stock | Use at 1:2000, 4% PFA fixation, Triton X100 at 0.1% |
| Penicillin/Streptomycin/Fungizone | Gibco Invitrogen | 15240-062 | |
| Podoplanin, Mouse anti Podoplanin antibody | Acris | DM3614P | Use at 1:250, 4% PFA fixation, avoid Triton X100 |
| Poly-L-ornithine | Sigma | P3655 | |
| Putrescine | Sigma | P5780 | Skin and eye irritant. Appropriate protection required. |
| Sodium selenite | Sigma | S5261 | |
| Sox10, Rabbit anti Sox10 antibody | Millipore Chemicon | AB5774 | Use at 1:200, 4% PFA fixation, Triton X100 at 0.1% |
| TGFb1, rhTGFb1 | RnD Systems | 240-B-010 | |
| Uncoated Petri dishes | Falcon Corning | 351029 |
References
- Nieto, M. A. Epithelial-Mesenchymal Transitions in development and disease: old views and new perspectives. Int J Dev Biol. 53, 1541-1547 (2009).
- Sauka-Spengler, T., Bronner-Fraser, M. A gene regulatory network orchestrates neural crest formation. Nat Rev Mol Cell Biol. 9, 557-568 (2008).
- Barriere, G., Fici, P., Gallerani, G., Rigaud, M. Mesenchymal Transition: a double-edged sword. Clin Transl Med. 4, 14 (2015).
- Zawadzka, M., et al. CNS-resident glial progenitor/stem cells produce Schwann cells as well as oligodendrocytes during repair of CNS demyelination. Cell Stem Cell. 6, 578-590 (2010).
- Paxinos, G., Ashwell, K. W. S., Törk, I. . Atlas of the developing rat nervous system. , (1994).
- O’Leary, D. D., Chou, S. J., Sahara, S. Area patterning of the mammalian cortex. Neuron. 56, 252-269 (2007).
- O’Leary, D. D., Sahara, S. Genetic regulation of arealization of the neocortex. Curr Opin Neurobiol. 18, 90-100 (2008).
- Sailer, M. H., et al. Non-invasive neural stem cells become invasive in vitro by combined FGF2 and BMP4 signaling. J Cell Sci. 126, 3533-3540 (2013).
- Sailer, M. H., et al. BMP2 and FGF2 cooperate to induce neural-crest-like fates from fetal and adult CNS stem cells. J Cell Sci. 118, 5849-5860 (2005).
- Sailer, M., Oppitz, M., Drews, U. Induction of cellular contractions in the human melanoma cell line SK-mel 28 after muscarinic cholinergic stimulation. Anat Embryol (Berl). 201, 27-37 (2000).
- Wicki, A., Christofori, G. The potential role of podoplanin in tumour invasion. Br J Cancer. 96, 1-5 (2007).
- Wicki, A., et al. Tumor invasion in the absence of epithelial-mesenchymal transition: podoplanin-mediated remodeling of the actin cytoskeleton. Cancer Cell. 9, 261-272 (2006).
- Mishima, K., et al. Increased expression of podoplanin in malignant astrocytic tumors as a novel molecular marker of malignant progression. Acta Neuropathol. 111, 483-488 (2006).
- Motomura, K., et al. Immunohistochemical analysis-based proteomic subclassification of newly diagnosed glioblastomas. Cancer Science. 103, 1871-1879 (2012).
- Kono, T., et al. Immunohistochemical detection of the lymphatic marker podoplanin in diverse types of human cancer cells using a novel antibody. Int J Oncol. 31, 501-508 (2007).
- Raica, M., Cimpean, A. M., Ribatti, D. The role of podoplanin in tumor progression and metastasis. Anticancer Res. 28, 2997-3006 (2008).
- Panchision, D. M., McKay, R. D. The control of neural stem cells by morphogenic signals. Curr Opin Genet Dev. 12, 478-487 (2002).
- Lamouille, S., Xu, J., Derynck, R. Molecular mechanisms of epithelial-mesenchymal transition. Nat Rev Mol Cell Biol. 15, 178-196 (2014).
- Gonzalez-Perez, O., Alvarez-Buylla, A. Oligodendrogenesis in the subventricular zone and the role of epidermal growth factor. Brain Res Rev. 67, 147-156 (2011).
- Hu, J. G., et al. PDGF-AA mediates B104CM-induced oligodendrocyte precursor cell differentiation of embryonic neural stem cells through Erk, PI3K, and p38 signaling. J Mol Neurosci. 46, 644-653 (2012).
- Galvao, R. P., et al. Transformation of quiescent adult oligodendrocyte precursor cells into malignant glioma through a multistep reactivation process. Proc Natl Acad Sci U S A. 111, E4214-E4223 (2014).
- Liu, C., et al. Mosaic analysis with double markers reveals tumor cell of origin in glioma. Cell. 146, 209-221 (2011).
- Das, S., Srikanth, M., Kessler, J. A. Cancer stem cells and glioma. Nat Clin Pract Neurol. 4, 427-435 (2008).
- Modrek, A. S., Bayin, N. S., Placantonakis, D. G. Brain stem cells as the cell of origin in glioma. World J Stem Cells. 6, 43-52 (2014).
- Sampetrean, O., et al. Invasion precedes tumor mass formation in a malignant brain tumor model of genetically modified neural stem cells. Neoplasia. 13, 784-791 (2011).
- McNeill, R. S., et al. Modeling astrocytoma pathogenesis in vitro and in vivo using cortical astrocytes or neural stem cells from conditional, genetically engineered mice. JoVE. , e51763 (2014).
- Lara-Padilla, E., Caceres-Cortes, J. R. On the nature of the tumor-initiating cell. Curr Stem Cell Res Ther. 7, 26-35 (2012).
- Busch, C., et al. BMP-2-dependent integration of adult mouse subventricular stem cells into the neural crest of chick and quail embryos. J Cell Sci. 119, 4467-4474 (2006).
- Thiery, J. P., Acloque, H., Huang, R. Y., Nieto, M. A. Epithelial-mesenchymal transitions in development and disease. Cell. 139, 871-890 (2009).
- McDonald, O. G., Wu, H., Timp, W., Doi, A., Feinberg, A. P. Genome-scale epigenetic reprogramming during epithelial-to-mesenchymal transition. Nat Struct Mol Biol. 18, 867-874 (2011).
- Rahimi, R. A., Leof, E. B. TGF-beta signaling: a tale of two responses. J Cell Biochem. 102, 593-608 (2007).
- Xu, J., Lamouille, S., Derynck, R. TGF-beta-induced epithelial to mesenchymal transition. Cell Res. 19, 156-172 (2009).
- Suva, M. L., Riggi, N., Bernstein, B. E. Epigenetic reprogramming in cancer. Science. 339, 1567-1570 (2013).
- Sullivan, R., et al. A possible new focus for stroke treatment – migrating stem cells. Expert Opin Biol Ther. , 1-10 (2015).
