Invasion of surrounding normal tissues is a defining characteristic of malignant tumors. We provide here a simple, semi-automated micro-plate assay of invasion into a natural 3D biomatrix that has been exemplified with a number of models of advanced human cancers.
Invasjon av omliggende normalt vev er generelt ansett å være en viktig kjennetegn på ondartet (i motsetning til godartet) svulster. For noen kreftformer i særdeleshet (f.eks hjernesvulster som glioblastoma multiforme og plateepitelkarsinom i hode og hals -. SCCHN) det er en årsak til alvorlig sykdom og kan være livstruende, selv i fravær av fjernmetastaser. I tillegg kreft som har fått tilbakefall etter behandling dessverre ofte har en mer aggressiv fenotype. Derfor er det en mulighet for å målrette prosessen med invasjon for å tilveiebringe nye behandlingsformer som kan være komplementært til vanlige anti-proliferative midler. Til nå har denne strategien vært hemmet av mangel på robuste, reproduserbare analyser egnet for en detaljert analyse av invasjonen og for narkotika screening. Her gir vi en enkel mikroplate metoden (basert på uniform, selvsammen 3D tumor kuler) som har stort potensial for en slik studør. Vi eksemplifisere analysen plattformen ved hjelp av en human glioblastoma cellelinje, og også en SCCHN modell der utvikling av resistens mot målrettet epidermal vekstfaktor-reseptor (EGFR) er assosiert med øket matriks-invasiv potensial. Vi tilbyr også to alternative metoder for semi-automatisert kvantifisering: en bruker bilde cytometer og andre som rett og slett krever standard mikroskopi og bildeopptak med digital bildeanalyse.
Klassiske anticancerlegemiddelutvikling i stor grad fokusert på anvendelse av in vitro celle-baserte analyser for å skjerm for cytotoksiske midler som hemmer tumorcelle-proliferasjon og / eller fremmer programmert celledød (apoptose). I den senere tid har forsøk beveget seg mot målrettet terapi med utvikling av inhibitorer av den underliggende molekylære årsakene til ondartet celleproliferasjon. Til tross for noen bemerkelsesverdige resultater, er slike midler ofte forbundet med den raske utviklingen av medikamentresistens. Gitt at det er invasiv og metastatisk potensial av kreftceller som er ansvarlig for de fleste kreftdødsfall, og at residiverende sykdom som presenterer ofte en mer aggressiv fenotype, er det logisk også å vurdere utfyllende in vitro eksperimentelle modeller 1,2 til å identifisere roman agenter som vil hemme disse ekstra taste 'kjennetegn' kreft.
Under ondartet progresjon, tumorceller erverveevnen til å invadere omkringliggende vev og / eller spre seg til fjerne organer (metastase). Kreftceller trenge gjennom basalmembranen ved dannelsen av invadopodia 3,4. Disse strukturene er beriket med aktin filamenter, spesifikke adhesjonsproteiner og proteinases og samlet er ansvarlig for svulst cellemotilitet og nedbrytning av ekstracellulær matrix (ECM) 5. Invadopodia strekker seg inn i ECM og antas å være viktig for tumorcelle invasjon og også bloduttredelse i vaskulære kanaler, tilrettelegging hematogenous (eller lymfesystemet) formidling og metastasering.
Dagens standard metoder for å vurdere svulst celle invasjon in vitro inkluderer følgende. Transwell-baserte eller Boyden kammer assays 2,6 hvor enkeltcellesuspensjoner blir sådd på toppen av et filter belagt med et tykt lag av ECM-avledede proteiner. Celler deretter invadere og bevege seg inn i det nedre kammer som reaksjon på en chemo-lokkemiddel. Vanligvis brukes ECMproteiner er type I kollagen, eller en basalmembran-lignende matrise (BMM, f.eks Matrigel, avledet fra EHS tumor 7) som etterligner den naturlige sammensetning av basalmembraner.
Som et alternativ til filterbaserte Boyden kammertypen assays 8, kan celler sådd på toppen av en ECM-gel (som fibroblaster kan tilsettes), hvor de danner et monolag, og deretter individuelt eller kollektivt invadere inn i gelen. Invasjon kan måles i form av antall invaderende celler og / eller avstand reist fra geloverflaten 9. Tumorceller kan også være helt innleiret i en matrise, enten som en enkelt cellesuspensjon eller som kuler – vanligvis er plassert mellom to lag av gel-ECM tillater celler å invadere ut av tumormasse inn i den omgivende matrise 2,6,10,11.
Den tre-dimensjonale (3D) tumorcelleklump invasjon analysen beskrevet her tilveiebringer en hurtig, automatiserbar invasjon system ved hjelp av en highly reproduserbar og standardisert metode 12 i et 96-brønners plateformat med en sfæroide per brønn. BMM tilsettes direkte til hver brønn for å gi et semi-fast matriks til hvilken tumorceller å invadere fra den sfæroide kroppen. Omfanget av tumorcelle-invasjon overvåkes i intervaller over en periode på 72-96 timer. Denne metoden gir følgende fordeler i forhold til de nåværende in vitro-invasjons assays som er nevnt ovenfor: tumorcellene er organisert i en 3D-struktur etterligne en tumor mikro-region eller en mikro-metastase; tumor kuler er svært reproduserbare i størrelse; invasjonen Analysen utføres in situ i den samme plate som tumorcelleklump utvikling, uten behov for å flytte dem til sekundære plater; metoden, kombinert med den nyeste teknologien for automatisk bildeanalyse, muliggjør både høyt innhold og høy gjennomstrømming analyser av tumorcelle invasjon.
Den bildeanalyse blir utført ved hjelp av en avbildnings cytometer, som skanner en 96-brønnersplate i 10 min. Ved bruk av samløpet søknad, graden og hastigheten av invasjon oppnådd enten ved enkle celler eller cellegrupper spres ut fra tumor sfæroidene og invaderende i matriksen kan måles på en dynamisk måte. For lavere gjennomstrømning, er en alternativ metode for bildeanalyse presenteres, basert på bruk av et invertert mikroskop og standard bildebehandling.
De to tumormodeller som er beskrevet her (glioblastom og SCCHN) ble spesielt utvalgt for å eksemplifisere vår 3D-analysen som de er klinisk relevante lokalt invasive kreftformer med et udekket behov for effektive behandlingsformer 12. Etter behandling, vurdering av in vitro farmakodynamiske (PD) biomarkør endringer kan utføres enkelt ved western blot eller immunologiske analyser av lysater etter bruk av spesifikke kommersielt tilgjengelige reagenser for å tillate celle utvinning fra BMM og / eller analyse av immunofluorescent invaderer tumor sfæroider av hele mount farging.
Denne invasjonen-analysen er en nyttig teknikk for rask og reproduserbar vurdering av tumorcelle invasjon i en halvfast medium og derfor spesielt egnet for fremtidig in vitro legemiddel-screening. Kreftceller invadere matrisen i et 3D måte som de spres ut fra en "micro-tumor", representert ved tumor sfæroide, og strekker seg inn i en extracellular matrise-lignende miljø. Den sanne tredimensjonalitet til analysen er tydelig i cellemorfologi, som er forskjellig fra den flate, tilhenger morfologi cellene anta når det beveger seg på et fast substrat. Graden av invasjonen enkelt kvantifiseres ved hjelp av enten en bilde cytometer, slik at en automatisert lese-out, eller ved å bruke en standard mikroskop i kombinasjon med bildebehandlingsprogrammer. Dessuten er denne fremgangsmåten egnet for fluoriserende bilde 13 (for eksempel med cellelinjer som uttrykker fluorescerende proteiner eller pre-merket med fluorescerende fargestoffer).
Fremgangsmåten er enkel å utføre med den eneste kritiske trinn er representert ved tilsetning av BMM, når det er en risiko for å forstyrre den sentrale posisjonen av den sfæroide i den U-formede brønnen. Dette kan resultere i suboptimal bildeanalyse, med kuler i forskjellige fokalplanene. Det er derfor avgjørende å tilsette BMM forsiktig og langsomt til hver brønn. Etter BMM tillegg er det lurt å sjekke platenunder et mikroskop, og hvis lokalisering anses uakseptabelt, dette kan avhjelpes ved forsiktig sentrifugering. Med erfaring, er dette sjelden nødvendig. Mens denne fremgangsmåte er robust og meget reproduserbar, kan inter eksperimentelle variasjoner forekomme med forskjellige satser av BMM. For å unngå dette, er det lurt å kjøpe tilstrekkelig BMM fra et enkelt parti å fullføre en rekke studier.
En begrensning av fremgangsmåten (som for slike analyser) er vanskeligheten med å skille mellom invasjon og proliferasjon, som tumorcellene sannsynlig gjennomgå under analysen tidsramme. Selv om doblingstiden av celler kan bli tatt hensyn til, eller cellesyklus inhibitorer så som cytokalasin D innført, er det ikke lett å kontrollere eller klart skille mellom disse to ulike aspekter av tumorprogresjon, spesielt for hurtig voksende tumorceller, og for de som ha en mer "ekspansiv", heller enn infiltrerende, invasjon mønster. Av denne grunner det foreslått at en parallell 3D-vekstanalyse er utført for å evaluere virkningene av eventuelle spesifikke hemmende eller stimulerende midler. Hvis imidlertid doseresponsstudier utføres, kan det være mulig å velge konsentrasjoner som minimerer effekter på proliferasjon. For eksempel har vi vist at den HSP90-inhibitor som inhiberer 17-AAG U-87 MG 3D tumor invasjon sfæroide allerede ved 24 timer og ved konsentrasjoner under konsentrasjonen som inhiberer 3D-vekst ved 50% (GI 50) 12.
På den annen side er betydningen av denne analysen sammenlignet med andre standard invasjon assays (f.eks, filterbaserte analyser eller invasjon av enkeltceller til 3D-matriser 1), er at tumorceller invadere i den omgivende grunnmasse fra den sfæroide, som ligner en " mikro-tumor "eller" micro-metastasering ", og dermed tar hensyn til viktige sider ved patofysiologien til en tumormasse. Metoden vi presenterer gir informasjon omkollektive oppførsel av tumorceller, når utgangspunktet forlater kulene, og også individuelt, hvis enkeltceller nå mer fjerntliggende områder i BMM. I tillegg kan cellene i tumor sfæroidene oppleve hypoksi og næringsmangel som, gjennom endringer i genekspresjon, kan fremme migrering og invasjon; slike funksjoner er fraværende i 2D analyser. Dessuten er alt dette tilgjengelig i en high-throughput format gjennom bruk av bestemte 96-brønners plater og den nyeste bildeteknologi, slik at en mer kompleks 3D-analyse for å enkelt brukes i mål validering og medisiner.
Metoden vi presenterer kan huse ytterligere programmer for å håndtere flere aspekter av tumorcelle invasjon. Spesielt kan ekstra kompleksitet tenkes ved tilsetning av vertsceller, så som fibroblaster og / eller endotelceller, i den sfæroide selv eller den omgivende matrise. Dette kan også endres, ikke bare i form av stivhet (ved bruk av ulike concentrations av BMM), men også i form av sammensetning (ved tilsetting av andre komponenter avhengig av den spesifikke vev / organ i vedtatt tumor modell: f.eks tenascin for hjernekreft 16 og kollagen for brystkreft 17).
Et tilsvarende opplegg (dannelse av sfæroider og imaging) kan også være innrettet til å vurdere vevsinvasjon i 3D, hvor tumor sfæroider er ko-dyrket med embryoide legemer som likner en kompleks vev 12 eller sammen med andre cellespesifikke organoids (f.eks astrocytter for glioma 18 eller krypten kulturer for gastrointestinal kreft), men ytterligere arbeid er nødvendig for å muliggjøre automatisert bildeanalyse.
The authors have nothing to disclose.
This work was funded by The National Centre for the Replacement, Refinement and Reduction of Animals in Research (G1000121 ID no.94513) and the Oracle Cancer Trust. SE is supported by The Institute of Cancer Research and Cancer Research UK (grant number C309/A8274). We acknowledge NHS funding to the NIHR Biomedical Research Centre.
Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Web address |
Corning Matrigel Basement Membrane Matrix | Corning | 354234 | http://www.corning.com Keep at 4 °C to prevent solidification and dispense using cooled pipette tips |
Cultrex Basement Membrane Extract, PathClear | Trevigen | 3432-005-01 | http://www.trevigen.com Keep at 4 °C to prevent solidification and dispense using cooled pipette tips |
Ultra-low attachment 96-well plate | Corning | 7007 | http://www.corning.com |
EGF | Miltenyi Biotec | 130-093-825 | http://www.miltenyibiotec.com Add 100 µl 1% BSA (w/v) in water to 100 µg EGF. To 25 µl of this, add 4,975 µl RHB-A medium to give a 10 µg/ml working stock. Aliquot and store at -20ºC |
RHB-A medium | Stem Cells Inc. | SCS-SF-NB-01 | http://www.stemcellsinc.com For diluting EGF |
DMEM | GIBCO | 31966-021 | http://www.lifetechnologies.com/ Warm in 37 °C waterbath before use |
Fetal Bovine Serum | Biosera | 1001/500 | http://www.biosera.com Heat at 56 °C to inactivate complement before use |
TrypLE | GIBCO | 12605 | http://www.lifetechnologies.com/ Cell dissociation solution |
Celigo cytometer | Nexcelom Bioscience | n/a | http://www.nexcelom.com Specialist equipment for image capture and analysis. Manual image capture by microscopy and independent image analysis software is an alternative |
IX70 inverted microscope | Olympus | n/a | http://www.olympus.co.uk/ Used with camera for manual image capture |
Retiga Exi Fast 1394 digital camera | Qimaging | n/a | http://www.qimaging.com/ Attached to microscope for manual image capture |
Image-Pro Plus 7.0 | Media Cybernetics | n/a | http://www.mediacy.com/ Software used to control camera and microscope for manual image capture |
Image-Pro Analyzer 7.0 | Media Cybernetics | n/a | http://www.mediacy.com/ Stand-alone image analysis software for manual measurment of spheroid size |
Excel 2010 | Microsoft | n/a | http://www.microsoft.com/ Scientific graphing and statistical software |
Prism 6.0 | GraphPad | n/a | http://www.graphpad.com/ Scientific graphing and statistical software |