Трехмерная (3D) опухоли Сфероид Вторжение Пробирной
Summary
Invasion of surrounding normal tissues is a defining characteristic of malignant tumors. We provide here a simple, semi-automated micro-plate assay of invasion into a natural 3D biomatrix that has been exemplified with a number of models of advanced human cancers.
Abstract
Вторжение окружающих нормальных тканей, как правило, считается признаком ключ злокачественной (в отличие от доброкачественных опухолей). Для некоторых видов рака, в частности (например, опухоли головного мозга, такие как глиобластомы и плоскоклеточного рака головы и шеи. – ПРГШ) это причиной тяжелой заболеваемости, и может быть опасным для жизни даже в отсутствие отдаленных метастазов. Кроме того, рак, которые рецидив после лечения, к сожалению, часто присутствует с более агрессивным фенотипа. Таким образом, существует возможность для целевой процесс вторжения в создании новых методов лечения, которые могли бы служить дополнением к стандартным антипролиферативным агентов. До сих пор эта стратегия не была затруднена из-за отсутствия надежных, воспроизводимых анализов, пригодных для детального анализа вторжения и для скрининга лекарственных средств. Здесь мы предлагаем простой способ микро-плиты (на основе форме, самоорганизации 3D сфероидов опухоли), которая имеет большой потенциал для такой ГТУумирает. Мы примером анализа платформу, используя человеческую линию клеток глиобластомы, а также модели, где ПРГШ развитие резистентности против целевой рецептор эпидермального фактора роста (EGFR ингибиторов) связано с повышенной потенциала матрицы-инвазивным. Мы также предоставляем две альтернативные методы полуавтоматической количественной: один с использованием изображений цитометр и второй, который просто требует стандартного микроскопа и изображения захват с цифрового анализа изображений.
Introduction
Классическая развитие противоопухолевый препарат в основном сосредоточены на использовании в пробирке клеточных анализов для выявления цитотоксических агентов, которые ингибируют пролиферацию опухолевых клеток и / или способствуют запрограммированной смерти клеток (апоптоза). В последнее время усилия были направлены на достижение целевых методов лечения с развитием ингибиторов лежащих в основе молекулярных причин распространения злокачественных клеток. Несмотря на впечатляющие результаты, такие агенты часто связаны с быстрым развитием лекарственной устойчивости. Учитывая, что это инвазивных и метастатический потенциал опухолевых клеток, что является ответственным за большинство случаев смерти от рака, и что рецидив болезни, часто представляет собой более агрессивный фенотип, логично также учитывать дополняют друг друга в пробирке экспериментальных моделях 1,2, чтобы идентифицировать новые агенты, которые ингибируют эти дополнительные ключевые признаки "" рака.
Во злокачественной прогрессии, опухолевые клетки приобретаютВозможность для вторжения в окружающие ткани и / или распространению в отдаленные органы (метастазирование). Раковые клетки проникают в базальную мембрану с образованием invadopodia 3,4. Эти структуры обогащенный актиновых филаментов, определенных адгезионных белков и протеиназы и несут коллективную ответственность за подвижности опухолевых клеток и деградации внеклеточного матрикса (ЕСМ) 5. Invadopodia расширить в ECM и, как полагают, важны для вторжения опухолевых клеток, а также в Экстравазационным сосудистых каналов, облегчая гематогенным (или) распространение лимфатической и метастазирование.
Современные методы стандартные для оценки опухолевых клеток вторжение в пробирке включают следующее. Transwell основе или Бойденом камеры анализы 2,6, где одноклеточных суспензий высевают на верхней части фильтра, покрытого толстым слоем ECM полученных белков. Затем клетки вторгнуться и двигаться в нижнюю камеру в ответ на химио-аттрактантов. Обычно используется ECMбелки типа коллагена, или базальная мембрана, как матрица (ВММ, например, Матригель, полученный из опухоли EHS 7), который имитирует естественный состав базальных мембран.
В качестве альтернативы, основанной на фильтре Boyden камерного типа анализов 8, клетки могут быть посеяны на верхней части ECM гель (к которому может быть добавлен фибробласты), где они образуют монослой, а затем по отдельности или в совокупности вторжение в гель. Вторжение может быть измерена в терминах числа вторжения клеток и / или пройденное расстояние от поверхности геля 9. Опухолевые клетки также могут быть полностью погружены в матрицу либо в виде суспензии отдельных клеток или сфероидов – обычно размещены между двумя слоями ECM Гель позволяет клеткам вторжение из массы опухоли в окружающую матрицу 2,6,10,11.
Трехмерная (3D) опухоли сфероид вторжение анализа, описанного здесь обеспечивает быстрое, автоматизированы системы вторжения, используя highlу воспроизводимым, стандартизованный метод 12 в формате 96-луночного планшета с одним сфероида на лунку. БММ добавляют непосредственно в каждую лунку, чтобы обеспечить полутвердой матрице, в которую опухолевые клетки проникают из тела сфероида. Степень инвазии опухолевых клеток контролируется с интервалом в течение 72 – 96 часов. Этот метод имеет следующие преимущества по сравнению с существующими вторжения анализов в пробирке, упомянутых выше: опухолевые клетки организованы в 3D структуры имитируя микрорегион опухоли или микро-метастазы; опухолевые сфероиды высокой воспроизводимостью по размеру; Вторжение анализ выполняется на месте в той же пластинке, как развитие опухоли сфероида, без необходимости перемещать их для вторичных пластин; Метод, в сочетании с новейшими технологиями автоматизированного анализа изображений, позволяет как высокое содержание и высокая пропускная способность анализа вторжения опухолевых клеток.
Анализ изображений проводят с помощью визуализации цитометра, который сканирует 96-луночногоплита течение 10 мин. При использовании приложения слияния, степень и скорость вторжения достигнуто либо путем одиночных клеток или путем распространения кластеров клеток из опухолевых сфероидов и проникают в матрицу может быть измерена в динамической моде. Для меньшей пропускной способности, альтернативный метод для анализа изображений представлена на основе использования инвертированного микроскопа и стандартной обработки изображений.
Protocol
Representative Results
Discussion
Эти две модели опухоли, описанные здесь, (глиобластомы и ПРГШ) были специально выбраны для иллюстрации нашего анализа 3D, как они клинически значимых локально инвазивного рака с неудовлетворенной потребности в эффективных методов лечения 12. После медикаментозного лечения, оценки в пробирке изменений фармакодинамических (PD) биомаркеров может быть выполнена легко вестерн-блоттинга или иммунологических лизатов после использования специальных коммерчески доступных реагентов, чтобы позволить восстановление клеток от СМЛ и / или иммунофлуоресцентного анализа вторжения опухолевых сфероидов по вся Крепление окрашивание.
Это вторжение анализ является полезным методом для быстрого и воспроизводимого оценки вторжения опухолевых клеток в полутвердой среде и, следовательно, особенно подходит для будущего в пробирке скрининга наркотиков. Раковые клетки проникают в матрицу в 3D, как они распространяются от "микро-опухоль», в лице сфероида опухоли, а также расширить в extracellulAR-матрица, как окружающая среда. Истинный трехмерность анализа проявляется в морфологии клеток, который отличается от плоской, прилипшего морфологии клетки предполагать при перемещении на твердой подложке. Степень инвазии легко количественно с использованием либо изображений цитометра, позволяя автоматизированную считывания или с помощью стандартного микроскопа в сочетании с программным обеспечением обработки изображений. Кроме того, этот способ пригоден для флуоресцентных изображений 13 (например, с клеточных линий, экспрессирующих флуоресцентные белки или предварительно меченных флуоресцентными красителями).
Метод прост в исполнении, с той лишь критической стадии, представленной добавлением СМЛ, когда существует риск нарушения центральное положение сфероида в U-образную форму и. Это может привести к неоптимальной анализа изображений, с сфероидов в различных фокальных плоскостях. Поэтому очень важно, чтобы добавить BMM осторожно и медленно, чтобы каждый хорошо. После того ВММ целесообразно проверить плитупод микроскопом и, если локализация считается неприемлемым, это может быть исправлено путем осторожного центрифугирования. С опытом, это редко. Несмотря на то, этот метод является надежным и очень воспроизводимые, в-экспериментальное изменение может произойти с различными партиями СМЛ. Чтобы избежать этого, желательно, чтобы приобрести достаточное BMM из одной партии, чтобы завершить цикл исследований.
Ограничением метода (как и для любых таких анализов) является трудность в различении инвазии и пролиферации, который опухолевые клетки, скорее всего пройти во время проведения анализа кадра. Хотя время удвоения клеток может быть принято во внимание, или ингибиторы клеточного цикла, такие как цитохалазином D введена, она не так легко контролировать или четко различать эти два различных аспектов прогрессирования опухоли, особенно для быстрорастущих опухолевых клетках, и для тех, кто имеют более "обширный", а не инфильтративный, вторжение шаблон. По этой причинеон предположил, что параллельно 3D анализ роста осуществляется для оценки конкретных последствий любых тормозных или стимулирующих агентов. Если исследования отклика осторожность дозы выполняются, то можно выбрать концентрации, которые минимизируют воздействие на пролиферацию. Например, мы показали, что ингибитор HSP90 17-AAG ингибирует U-87 мг 3D опухоли сфероид вторжение уже через 24 часа и при концентрациях ниже концентрации ингибирования 3D рост на 50% (GI 50) 12.
С другой стороны, значение этого теста по сравнению с другими анализов стандартное инвазии (например, фильтровать на основе анализов или вторжения одиночных клеток в 3D матриксе 1), является то, что опухолевые клетки проникают в окружающую матрицу из сфероида, который напоминает " микро-опухоль "или" микро-метастазы ", и, следовательно, принимает во внимание важные аспекты патофизиологии опухолевой массы. Метод, который мы представляем предоставляет информацию околлективное поведение опухолевых клеток, когда изначально, оставляя сфероидов, а также индивидуально, когда отдельные клетки достигают более отдаленные регионы СМЛ. Кроме того, клетки в опухоли сфероидов могут возникнуть гипоксия и питательных веществ лишения, которые, через изменения в экспрессии генов, может способствовать миграции и инвазии; такие функции отсутствуют в 2D анализов. Более того, все это доступно в формате высокой пропускной посредством использования конкретных 96-а и новейших технологий обработки изображений, что позволяет более сложным 3D анализа, чтобы быть легко использован в проверке целевого и лекарственных препаратов.
Метод, который мы представляем могут разместиться дополнительные приложения, чтобы удовлетворить дополнительные аспекты вторжения опухолевых клеток. В частности, дополнительные сложности могут быть предусмотрены путем добавления клетках-хозяевах, таких как фибробласты и / или эндотелиальных клеток, в самой сфероида или окружающей матрицы. Это также может быть изменен, не только с точки зрения жесткости (за счет использования различных COncentrations из СМЛ), но и с точки зрения состава (путем добавления других компонентов, зависящих от конкретной ткани / органа принятой модели опухоли: например, тенасцином для рака мозга 16 и коллагена для рака молочной железы 17).
Аналогичное установка (генерация сфероидов и изображений) могут также быть приспособлены для оценки тканевой инвазии в 3D, где опухолевые сфероиды совместно культивировали с эмбриональных телец, напоминающих сложную ткань 12 или с другими органоидам соты (например, астроциты для глиомы 18 или склеп культуры для желудочно-кишечного тракта рака), но требуется дальнейшая работа для автоматизированного анализа изображений.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was funded by The National Centre for the Replacement, Refinement and Reduction of Animals in Research (G1000121 ID no.94513) and the Oracle Cancer Trust. SE is supported by The Institute of Cancer Research and Cancer Research UK (grant number C309/A8274). We acknowledge NHS funding to the NIHR Biomedical Research Centre.
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Web address |
| Corning Matrigel Basement Membrane Matrix | Corning | 354234 | http://www.corning.com Keep at 4 °C to prevent solidification and dispense using cooled pipette tips |
| Cultrex Basement Membrane Extract, PathClear | Trevigen | 3432-005-01 | http://www.trevigen.com Keep at 4 °C to prevent solidification and dispense using cooled pipette tips |
| Ultra-low attachment 96-well plate | Corning | 7007 | http://www.corning.com |
| EGF | Miltenyi Biotec | 130-093-825 | http://www.miltenyibiotec.com Add 100 µl 1% BSA (w/v) in water to 100 µg EGF. To 25 µl of this, add 4,975 µl RHB-A medium to give a 10 µg/ml working stock. Aliquot and store at -20ºC |
| RHB-A medium | Stem Cells Inc. | SCS-SF-NB-01 | http://www.stemcellsinc.com For diluting EGF |
| DMEM | GIBCO | 31966-021 | http://www.lifetechnologies.com/ Warm in 37 °C waterbath before use |
| Fetal Bovine Serum | Biosera | 1001/500 | http://www.biosera.com Heat at 56 °C to inactivate complement before use |
| TrypLE | GIBCO | 12605 | http://www.lifetechnologies.com/ Cell dissociation solution |
| Celigo cytometer | Nexcelom Bioscience | n/a | http://www.nexcelom.com Specialist equipment for image capture and analysis. Manual image capture by microscopy and independent image analysis software is an alternative |
| IX70 inverted microscope | Olympus | n/a | http://www.olympus.co.uk/ Used with camera for manual image capture |
| Retiga Exi Fast 1394 digital camera | Qimaging | n/a | http://www.qimaging.com/ Attached to microscope for manual image capture |
| Image-Pro Plus 7.0 | Media Cybernetics | n/a | http://www.mediacy.com/ Software used to control camera and microscope for manual image capture |
| Image-Pro Analyzer 7.0 | Media Cybernetics | n/a | http://www.mediacy.com/ Stand-alone image analysis software for manual measurment of spheroid size |
| Excel 2010 | Microsoft | n/a | http://www.microsoft.com/ Scientific graphing and statistical software |
| Prism 6.0 | GraphPad | n/a | http://www.graphpad.com/ Scientific graphing and statistical software |
References
- Astashkina, A., Mann, B., Grainger, D. W. A critical evaluation of in vitro cell culture models for high-throughput drug screening and toxicity. Pharmacology & therapeutics. 134 (1), 82-106 (2012).
- Zimmermann, M., Box, C., Eccles, S. Two-Dimensional vs. Three-Dimensional In Vitro Tumor Migration and Invasion Assays. Methods and Protocols. 986, 227-252 (2013).
- Hwang, Y. S., Park, K. K., Chung, W. Y. Invadopodia formation in oral squamous cell carcinoma: the role of epidermal growth factor receptor signalling. Arch. Oral. Biol. 57 (4), 335-343 (2012).
- Wang, S., et al. Study on invadopodia formation for lung carcinoma invasion with a microfluidic 3D culture device. PLoS One. 8 (2), e56448 (2013).
- Friedl, P., Alexander, S. Cancer invasion and the microenvironment: plasticity and reciprocity. Cell. 147 (5), 992-1009 (2011).
- Brekhman, V., Neufeld, G. A novel asymmetric 3D in-vitro assay for the study of tumor cell invasion. BMC Cancer. 9, 415 (2009).
- Kleinman, H. K., Martin, G. R. Matrigel: basement membrane matrix with biological activity. Semin. Cancer Biol. 15 (5), 378-386 (2005).
- Boyden, S. The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes. J. Exp. Med. 115, 453-466 (1962).
- Nystrom, M. L., et al. Development of a quantitative method to analyse tumour cell invasion in organotypic culture. The Journal of pathology. 205 (4), 468-475 (2005).
- Deisboeck, T. S., et al. Pattern of self-organization in tumour systems: complex growth dynamics in a novel brain tumour spheroid model. Cell Prolif. 34 (2), 115-134 (2001).
- Harma, V., et al. A comprehensive panel of three-dimensional models for studies of prostate cancer growth, invasion and drug responses. PLoS One. 5 (5), e10431 (2010).
- Vinci, M., et al. Advances in establishment and analysis of three-dimensional tumor spheroid-based functional assays for target validation and drug evaluation. BMC Biol. 10, 29 (2012).
- Vinci, M., Zimmermann, M., Box, C., Eccles, S. Tumor spheroid-based migration assays for evaluation of therapeutic agents. Methods and Protocols. , 253-266 (2013).
- Box, C., et al. A novel serum protein signature associated with resistance to epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitors in head and neck squamous cell carcinoma. Eur. J. Cancer. 49 (11), 2512-2521 (2013).
- Khajah, M. A., Al Saleh, S., Mathew, S., M, P., Luqmani, Y. A. Differential effect of growth factors on invasion and proliferation of endocrine resistant breast cancer cells. PLoS One. 7 (7), e41847 (2012).
- Brosicke, N., van Landeghem, F. K., Scheffler, B., Faissner, A. Tenascin-C is expressed by human glioma in vivo and shows a strong association with tumor blood vessels. Cell and tissue research. 354 (2), 409-430 (2013).
- Cheung, K. J., Gabrielson, E., Werb, Z., Ewald, A. J. Collective invasion in breast cancer requires a conserved basal epithelial program. Cell. 155 (7), 1639-1651 (2013).
- Molina, J. R., Hayashi, Y., Stephens, C., Georgescu, M. M. Invasive glioblastoma cells acquire stemness and increased Akt activation. Neoplasia. 12 (6), 453-463 (2010).
