Summary
Invasion of surrounding normal tissues is a defining characteristic of malignant tumors. We provide here a simple, semi-automated micro-plate assay of invasion into a natural 3D biomatrix that has been exemplified with a number of models of advanced human cancers.
Abstract
Invasão de tecidos normais circundantes é geralmente considerada como uma característica essencial do maligno (em oposição a tumores benignos). Para alguns tipos de câncer, em particular (por exemplo, tumores cerebrais, tais como o glioblastoma multiforme e carcinoma de células escamosas da cabeça e pescoço -. SCCHN) é uma causa de morbidade grave e pode ser até mesmo na ausência de metástases à distância com risco de vida. Além disso, os cânceres que têm recaída após o tratamento, infelizmente, muitas vezes presente com um fenótipo mais agressivo. Portanto, existe uma oportunidade para atingir o processo de invasão para fornecer novas terapias que podem ser complementares aos agentes anti-proliferativos normais. Até agora, esta estratégia tem sido dificultada pela falta de robustos, ensaios reprodutíveis adequadas para uma análise detalhada da invasão e para o rastreio de drogas. Aqui nós fornecemos um método simples micro-placa (baseado em uniforme, de auto-montagem esferóides tumorais 3D), que tem um grande potencial para tal stumorre. Nós exemplificar a plataforma de ensaio que utiliza uma linha celular de glioblastoma humano e também um modelo de SCCHN, onde o desenvolvimento de resistência contra os inibidores do receptor do factor de crescimento epidérmico (EGFR) alvo está associada com uma maior potencial invasivo matriz. Nós também fornecemos dois métodos alternativos de quantificação semi-automático: uma usando um citômetro de imagem e uma segunda que apenas exige microscopia e captura de imagem padrão, com análise de imagem digital.
Introduction
O desenvolvimento de drogas anti-cancro Clássica é em grande parte incidiu sobre a utilização de ensaios in vitro baseados em células para o rastreio de agentes citotóxicos que inibem a proliferação de células tumorais e / ou promovem a morte celular programada (apoptose). Mais recentemente, os esforços têm movido para terapias específicas com o desenvolvimento de inibidores das causas moleculares subjacentes da proliferação de células malignas. Apesar de alguns resultados espectaculares, tais agentes são frequentemente associados com o rápido desenvolvimento de resistência às drogas. Dado que é o potencial invasivo e metastático de células tumorais, que é responsável pela maioria das mortes de cancro, e que a doença relapsed muitas vezes apresenta um fenótipo mais agressivo, é lógico também considerar complementar em modelos experimentais in vitro 1,2 para identificar novos agentes que inibem estas "características" essenciais adicionais de câncer.
Durante a progressão maligna, as células tumorais adquirema habilidade de invadir os tecidos circundantes e / ou a propagação em órgãos distantes (metástases). As células cancerosas penetram na membrana basal pela formação de invadopodia 3,4. Estas estruturas são enriquecidos com filamentos de actina, proteínas de adesão e proteinases específicas e são colectivamente responsáveis para a motilidade de células tumorais e a degradação da matriz extracelular (ECM) 5. Invadopodia se estender para o ECM e acredita-se ser importante para a invasão de células tumorais e também o extravasamento em canais vasculares, facilitando hematógena (ou linfático) e disseminação de metástases.
Métodos padrão actuais para avaliar a invasão de células tumorais in vitro incluem o seguinte. Baseada em Transwell ou ensaios de câmara de Boyden 2,6 onde as suspensões de células únicas são semeadas em cima de um filtro revestido com uma camada de espessura de proteínas derivadas de ECM. As células, em seguida, invadir e mover para dentro da câmara inferior, em resposta a um quimio-atractor. Comumente usado ECMsão proteínas de colagénio tipo I, ou uma matriz de tipo membranar basal (BMM, por exemplo, Matrigel, derivada do tumor EHS 7) que mimetiza a composição natural de membranas basais.
Como uma alternativa ao tipo de câmara de Boyden ensaios baseados-filtro de 8, as células podem ser semeadas no topo de um gel de ECM (a que podem ser adicionados fibroblastos), onde elas formam uma monocamada e, em seguida, individualmente ou colectivamente invadir no gel. Invasão pode ser medido em termos de número de células e / ou a distância percorridas invasoras da superfície do gel de 9. As células tumorais também pode ser totalmente incorporado dentro de uma matriz, quer como uma suspensão de células individuais ou como esferóides – geralmente colocados entre duas camadas de ECM, permitindo distribuição do gel para invadir células para fora da massa do tumor para dentro da matriz circundante 2,6,10,11.
O ensaio em três dimensões (3D) esferóide invasão tumoral descrita aqui proporciona um sistema de invasão rápida, utilizando um automatizável highly método reprodutível, padronizada 12 num formato de placa de 96 poços com um esferóide por poço. BMM é adicionado directamente a cada cavidade para proporcionar uma matriz semi-sólido no qual as células de tumor invadir a partir do corpo esferóide. A extensão de invasão de células de tumor é monitorizado a intervalos ao longo de um período de 72-96 horas. Este método proporciona as seguintes vantagens sobre os actuais ensaios de invasão in vitro acima mencionadas: células do tumor são organizados dentro de uma estrutura 3D imitando um micro-região do tumor ou um micro-metástases; os esferóides tumorais são altamente reprodutíveis em tamanho; o ensaio de invasão é realizada in situ na mesma placa como desenvolvimento do tumor esferóide, sem a necessidade de movê-los para placas secundárias; o método, combinado com as tecnologias mais recentes de análise de imagem automatizado, permite que ambos os conteúdos de alta e análises de elevado rendimento de invasão de células tumorais.
A análise de imagem é realizada utilizando um citómetro de imagem, que digitaliza um de 96 poçosplaca dentro de 10 min. Ao utilizar a aplicação de confluência, o grau e velocidade de invasão conseguido quer por células individuais ou grupos de células por espalhamento para fora a partir dos esferóides tumorais e invasão para a matriz pode ser medido de uma forma dinâmica. Para menor rendimento, um método alternativo para a análise de imagem é apresentado, baseado na utilização de um microscópio invertido e software de imagem padrão.
Protocol
Representative Results
Discussion
Os dois modelos de tumor descritos aqui (glioblastoma e SCCHN) foram selecionados especificamente para exemplificar nosso ensaio 3D como eles são clinicamente cânceres invasivos localmente relevantes com uma necessidade não atendida de terapias eficazes 12. Após o tratamento de droga, a avaliação in vitro de alterações farmacodinâmica (PD) de biomarcadores pode ser efectuada facilmente por western blot ou imunoensaios de lisados após o uso de reagentes disponíveis comercialmente específicas para permitir a recuperação das células a partir de BMM e / ou análise de imunofluorescência de invadir esferóides tumorais por toda coloração de montagem.
Este ensaio de invasão é uma técnica útil para a avaliação rápida e reprodutível de invasão de células tumorais numa forma semi-sólida e, portanto, particularmente adequado para o futuro na triagem de drogas in vitro. As células cancerosas invadir a matriz de um modo 3D como espalham para fora a partir de um "micro-tumores", representado pela esferóide do tumor, e se estendem até um extracellulambiente ar matriz-like. O verdadeiro tridimensionalidade do ensaio é evidente na morfologia celular, que é diferente do plano, morfologia aderente células assumem quando se desloca sobre um substrato sólido. O grau de invasão pode ser facilmente quantificado usando um citómetro de imagem, permitindo uma leitura automatizada para fora, ou através da utilização de um microscópio padrão em combinação com o software de imagiologia. Além disso, este método é adequado para imagiologia fluorescente 13 (por exemplo, com linhas de células que expressam proteínas fluorescentes ou pré-marcada com corantes fluorescentes).
O método é simples de executar, com a única etapa crítica representada pela adição do BMM, quando existe um risco de perturbar a posição central do esferóide em forma de U bem. Isto pode resultar em sub-óptima de análise de imagem, com esferóides em diferentes planos focais. É, portanto, crucial para adicionar o BMM cuidadosamente e lentamente a cada poço. Depois de BMM Além disso, é aconselhável verificar a placasob um microscópio e se a localização é considerado inaceitável, esta pode ser corrigida por centrifugação suave. Com a experiência, isso raramente é necessário. Enquanto este método é muito robusta e reprodutível, variação inter-experimental poderia ocorrer com diferentes lotes de BMM. Para evitar isso, é aconselhável para adquirir suficiente BMM a partir de um único lote para completar uma série de estudos.
Uma limitação do método (como por quaisquer ensaios) é a dificuldade em distinguir entre invasão e a proliferação, as células tumorais que provavelmente sofrer durante o período de tempo do ensaio. Embora o tempo de duplicação de células podem ser tomadas em conta, ou inibidores do ciclo celular, tais como citocalasina D introduzida, não é fácil de controlar ou claramente distinguir entre estes dois aspectos diferentes da progressão do tumor, especialmente para o rápido crescimento de células tumorais e para aqueles que têm uma forma mais "expansivo", ao invés de infiltrativa, padrão de invasão. Por esta razãoSugere-se que um ensaio de crescimento 3D paralelo é realizado para avaliar os efeitos específicos de quaisquer agentes inibidores ou estimuladores. Se os estudos de resposta à dose cuidadosa são realizadas, pode ser possível para seleccionar concentrações que minimizem os efeitos sobre a proliferação. Por exemplo, têm mostrado que o inibidor de HSP90 17-AAG inibe U-87 MG 3D esferóide invasão tumor já às 24 h e a concentrações abaixo da concentração inibidora do crescimento 3D em 50% (GI50) 12.
Por outro lado, o significado deste ensaio em comparação com outros ensaios de invasão padrão (por exemplo, ensaios baseados em filtros ou invasão de células individuais em matrizes 3D 1), é que as células de tumor invadir a matriz circundante do esferóide, que se assemelha a um " micro-tumor "ou um" micro-metástases ", e, portanto, leva em consideração aspectos importantes da fisiopatologia de uma massa tumoral. O método que apresentamos fornece informações sobre ocomportamento colectivo de células tumorais, quando saem inicialmente os esferóides, e também individualmente, quando as células individuais atingir regiões mais distantes no BMM. Além disso, as células tumorais dentro esferóides podem experimentar hipóxia e nutrientes privação que, através de mudanças na expressão gênica, podem promover a migração e invasão; tais características estão ausentes em ensaios 2D. Além disso, tudo isso está disponível num formato de alto rendimento, através da utilização de placas de 96 poços específicas e a última tecnologia de imagem, permitindo um ensaio de 3D mais complexo para ser facilmente utilizado em validação de alvos e descoberta de drogas.
O método que apresentamos pode acomodar outros pedidos para tratar de aspectos adicionais de invasão das células tumorais. Em particular, a complexidade extra pode ser prevista através da adição de células hospedeiras, tais como os fibroblastos e / ou células endoteliais, no próprio esferóide ou a matriz circundante. Isto também pode ser modificado, não só em termos de rigidez (através da utilização de co diferentencentrations de BMM), mas também em termos de composição (por meio da adição de outros componentes dependentes do tecido / órgão específico do modelo adoptado tumor: por exemplo, para cancros do cérebro tenascina 16 e colagénio para o carcinoma da mama 17).
Um conjunto semelhante para (geração de esferóides e de imagem) também podem ser adaptados para avaliar a invasão de tecidos em 3D, onde os esferóides de tumor forem co-cultivadas com corpos embrióides se assemelham a um tecido complexo 12 ou com outros Organóides específicos de células (por exemplo, para os astrócitos glioma 18 ou cripta culturas para cancros gastrointestinais), mas é necessário mais trabalho para permitir a análise de imagem automatizada.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was funded by The National Centre for the Replacement, Refinement and Reduction of Animals in Research (G1000121 ID no.94513) and the Oracle Cancer Trust. SE is supported by The Institute of Cancer Research and Cancer Research UK (grant number C309/A8274). We acknowledge NHS funding to the NIHR Biomedical Research Centre.
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Web address |
| Corning Matrigel Basement Membrane Matrix | Corning | 354234 | http://www.corning.com Keep at 4 °C to prevent solidification and dispense using cooled pipette tips |
| Cultrex Basement Membrane Extract, PathClear | Trevigen | 3432-005-01 | http://www.trevigen.com Keep at 4 °C to prevent solidification and dispense using cooled pipette tips |
| Ultra-low attachment 96-well plate | Corning | 7007 | http://www.corning.com |
| EGF | Miltenyi Biotec | 130-093-825 | http://www.miltenyibiotec.com Add 100 µl 1% BSA (w/v) in water to 100 µg EGF. To 25 µl of this, add 4,975 µl RHB-A medium to give a 10 µg/ml working stock. Aliquot and store at -20ºC |
| RHB-A medium | Stem Cells Inc. | SCS-SF-NB-01 | http://www.stemcellsinc.com For diluting EGF |
| DMEM | GIBCO | 31966-021 | http://www.lifetechnologies.com/ Warm in 37 °C waterbath before use |
| Fetal Bovine Serum | Biosera | 1001/500 | http://www.biosera.com Heat at 56 °C to inactivate complement before use |
| TrypLE | GIBCO | 12605 | http://www.lifetechnologies.com/ Cell dissociation solution |
| Celigo cytometer | Nexcelom Bioscience | n/a | http://www.nexcelom.com Specialist equipment for image capture and analysis. Manual image capture by microscopy and independent image analysis software is an alternative |
| IX70 inverted microscope | Olympus | n/a | http://www.olympus.co.uk/ Used with camera for manual image capture |
| Retiga Exi Fast 1394 digital camera | Qimaging | n/a | http://www.qimaging.com/ Attached to microscope for manual image capture |
| Image-Pro Plus 7.0 | Media Cybernetics | n/a | http://www.mediacy.com/ Software used to control camera and microscope for manual image capture |
| Image-Pro Analyzer 7.0 | Media Cybernetics | n/a | http://www.mediacy.com/ Stand-alone image analysis software for manual measurment of spheroid size |
| Excel 2010 | Microsoft | n/a | http://www.microsoft.com/ Scientific graphing and statistical software |
| Prism 6.0 | GraphPad | n/a | http://www.graphpad.com/ Scientific graphing and statistical software |
References
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