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의학

Tumor Ensayo tridimensional (3D) esferoide Invasion

Published: May 01, 2015
doi:
10.3791/52686
, ,
1Division of Molecular Pathology,The Institute of Cancer Research, 2Division of Cancer Therapeutics,The Institute of Cancer Research

Summary

Invasion of surrounding normal tissues is a defining characteristic of malignant tumors. We provide here a simple, semi-automated micro-plate assay of invasion into a natural 3D biomatrix that has been exemplified with a number of models of advanced human cancers.

Abstract

La invasión de los tejidos normales circundantes se considera generalmente que es un sello distintivo clave de maligno (en contraposición a los tumores benignos). Para algunos tipos de cáncer, en particular (por ejemplo, tumores cerebrales tales como glioblastoma multiforme y carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello -. SCCHN) es una causa de morbilidad severa y puede ser peligrosa para la vida, incluso en ausencia de metástasis a distancia. Además, los cánceres que han recaído después del tratamiento por desgracia a menudo presente con un fenotipo más agresivo. Por lo tanto, hay una oportunidad para dirigir el proceso de invasión de proporcionar nuevas terapias que podrían ser complementaria a los agentes anti-proliferativos estándar. Hasta ahora, esta estrategia se ha visto obstaculizada por la falta de, ensayos reproducibles sólidas adecuadas para un análisis detallado de la invasión y para la detección de drogas. Aquí se proporciona un método de micro-placa sencilla (basado en uniforme, auto-montaje esferoides tumorales 3D), que tiene un gran potencial para tal stumuere. Ejemplificamos la plataforma de ensayo utilizando una línea celular de glioblastoma humano y también un modelo CECC donde el desarrollo de la resistencia contra los inhibidores del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) dirigida está asociada con una mayor posibilidad de matriz invasiva. También ofrecemos dos métodos alternativos de cuantificación semiautomática: uno utilizando un citómetro de imagen y una segunda, que simplemente requiere microscopía y de imagen estándar de captura con análisis digital de imágenes.

Introduction

El desarrollo de fármacos contra el cáncer clásica es en gran medida centrado en el uso de ensayos in vitro basados ​​en células en a la pantalla para los agentes citotóxicos que inhiben la proliferación de células tumorales y / o promover la muerte celular programada (apoptosis). Más recientemente, los esfuerzos se han movido hacia terapias dirigidas con el desarrollo de inhibidores de las causas moleculares subyacentes de la proliferación de células malignas. A pesar de algunos resultados espectaculares, tales agentes están a menudo asociados con el rápido desarrollo de la resistencia a los medicamentos. Dado que es el potencial invasor y metastásico de las células tumorales que es responsable de la mayoría de las muertes por cáncer, y que a menudo recaída de la enfermedad presenta un fenotipo más agresivo, es lógico también considerar complementaria en modelos experimentales in vitro 1,2 a identificar nuevos agentes que inhiben estos adicionales "señas de identidad" clave de cáncer.

Durante la progresión maligna, las células tumorales adquierenla capacidad de invadir el tejido circundante y / o extenderse a órganos distantes (metástasis). Las células cancerosas penetran en la membrana basal por la formación de invadopodios 3,4. Estas estructuras están enriquecidos con filamentos de actina, proteínas de adhesión específicas y proteinasas y son colectivamente responsables de la motilidad de las células tumorales y la degradación de la matriz extracelular (ECM) 5. Invadopodios se extienden en el ECM y se cree que son importantes para la invasión de células tumorales y también extravasación en canales vasculares, facilitando hematógena (o linfática) la difusión y la metástasis.

Métodos estándar actuales para evaluar la invasión de células tumorales in vitro incluyen lo siguiente. Transwell o basado en ensayos de cámara de Boyden 2,6 donde suspensiones de células individuales se siembran en la parte superior de un filtro recubierto con una capa gruesa de proteínas ECM-derivado. Las células entonces invaden y se mueven en la cámara inferior en respuesta a una quimio-atrayente. Comúnmente usado ECMproteínas son colágeno de tipo I, o una matriz de tipo membrana basal (BMM, por ejemplo, Matrigel, derivado del tumor EHS 7) que imita la composición natural de las membranas basales.

Como una alternativa a los ensayos de tipo de cámara de Boyden basados ​​en filtros 8, las células pueden sembrarse en la parte superior de un gel de ECM (a la que se pueden añadir fibroblastos) donde forman una monocapa y luego individualmente o colectivamente invadir en el gel. Invasion se puede medir en términos de número de células y / o distancia invasores viajado desde la superficie del gel 9. Las células tumorales también pueden ser completamente embebidas en una matriz, ya sea como una única suspensión celular o como esferoides – por lo general colocados entre dos capas de ECM de gel permitiendo que las células invaden fuera de la masa tumoral en la matriz circundante 2,6,10,11.

El (3D) ensayo de invasión tumoral esferoide tridimensional descrito aquí proporciona un sistema de rápida invasión, automatizable mediante un highly método reproducible, estandarizada 12 en un formato de placa de 96 pocillos con un esferoide por pocillo. BMM se añade directamente a cada pocillo para proporcionar una matriz semi-sólido en el cual las células tumorales invaden desde el cuerpo esferoide. La extensión de la invasión de células tumorales se controla a intervalos durante un período de 72 a 96 hr. Este método proporciona las siguientes ventajas sobre los ensayos actuales in vitro de invasión mencionados anteriormente: el tumor células se organizan en una estructura 3D imitando un micro-región del tumor o una micro-metástasis; los esferoides tumorales son altamente reproducibles en tamaño; el ensayo de invasión se realiza in situ en la misma placa como el desarrollo esferoide tumor, sin la necesidad de moverlos a placas secundarias; el método, combinado con las últimas tecnologías de análisis de imágenes automatizado, permite tanto alto contenido y análisis de alto rendimiento de la invasión de las células tumorales.

El análisis de imágenes se realizó utilizando un citómetro de formación de imágenes, que escanea un 96 pocillosplaca dentro de 10 minutos. Mediante el uso de la aplicación de confluencia, el grado y velocidad de invasión lograrse ya sea por las células individuales o por grupos de células se extienden hacia fuera de los esferoides tumorales e invadiendo en la matriz se puede medir de una manera dinámica. Para un rendimiento inferior, se presenta un método alternativo para el análisis de imagen, basado en el uso de un microscopio invertido y software de imagen estándar.

Protocol

1. Generación de forma reproducible esferoides tumorales Sized Lavar las monocapas de células tumorales con solución salina tamponada con fosfato (PBS; 5 ml para un 25 cm 2 o 8 – 10 ml para un matraz de 75 cm 2), añadir enzima de disociación de células (1 ml de un 25 cm 2 o 2 ml de un 75 cm 2 frasco) e incubar las células a 37 ° C durante 2-5 min. Compruebe el desprendimiento de células bajo un microscopio y neutralizar enzima de disociación de células con medio de crecimiento completo (5 ml para un 25 cm 2 o 8 ml para un matraz de 75 cm 2). Suspensión de células Centrifugar a 500 xg durante 5 min. Aspirar el sobrenadante, toque el tubo y volver a suspender el sedimento celular en 1 ml de medio de cultivo completo usando una pipeta P1000. Esto debería producir una suspensión de células individuales sin grupos de células. Recuento de células utilizando un hemocitómetro y se diluye la suspensión celular para obtener 0,5-2 x 10 4 células / ml (densidad celular óptima debe determinarse para cada línea celular en order para obtener esferoides tumorales de 300 a 500 micras de diámetro 4 días después de la siembra de células 12,13). Transferir la suspensión celular a un depósito estéril y, utilizando una pipeta multicanal, dispense 200 l / pocillo en ultra bajo apego (ULA) placas de 96 pocillos de fondo redondo 12. Transferir las placas a una incubadora (37 ° C, 5% de CO 2, 95% de humedad). Cuatro días después, confirmar visualmente la formación de esferoides de tumor y proceder con el ensayo de invasión 3D. 2. Tumor 3D Ensayo esferoide Invasion Descongele BMM en hielo. Mantenga un conjunto de puntas con filtro estériles para P10, P200 y P1000 pipetas y tubos estériles (1,5 ml de volumen o mayor dependiendo del volumen total requerido) a -20 ° C. Colocar las placas de 96 pocillos que contienen 4-ULA días de edad esferoides en hielo. Con una pipeta multicanal, retire suavemente 100 l / pocillo de medio de crecimiento de las placas esferoide. Para este ángulo paso la punta hacia la inside pared de los pocillos de fondo en U, evitando el contacto con el fondo del pozo y la ubicación de los esferoides; minimizar la perturbación de los esferoides. Utilizando puntas heladas, transferir BMM a tubos heladas. Para invasión inducida por citoquinas o de los estudios de evaluación de drogas, agregue los reactivos (a 2x la concentración final) a la BMM utilizando puntas heladas. Por ejemplo, utilizar el factor de crecimiento epidérmico (EGF) para estimular la invasión de células de carcinoma escamoso CAL CAL S y R. Mezclar bien girando suavemente, evitando la formación de burbujas. Dispensar suavemente 100 l de BMM en el pozo de fondo en U, con el objetivo de la punta hacia la pared interior del pozo. Este paso es el más crítico como, por análisis de imagen óptima, esferoides deben permanecer en el centro del pozo 12. Repita el paso 2.6 para todos los pozos requeridos, permitiendo 5-6 repeticiones / condición. Si es necesario, cambie a una punta recién enfriada. NOTA: Cuando más experiencia, dosificarse BMM utilizando una pipeta multicanal. Usando una aguja estéril, eliminar las burbujas, si está presente. Usando un microscopio, comprobar visualmente que esferoides están en una posición central. Si no, centrifugar la placa a 300 xg durante 3 min a 4 ° C. Esto asegurará que los esferoides se encuentran en el centro de cada pocillo. La transferencia de la placa a una incubadora a 37 ° C y permitir que el BMM se solidifique. 1 hr más tarde, utilizando una pipeta multicanal, añadir suavemente 100 l / pocillo de medio de crecimiento completo. Para invasión o evaluación de drogas estudios inducida por citoquinas, incluyen citoquinas o inhibidores en el medio (1x concentración final). Alternativamente, si los reactivos no se han añadido a la BMM en el paso 2.5, añadirlos al medio en este punto (3 veces la concentración final deseada). 3. Automated Image Acquisition Placas de exploración en el citómetro (para ver las especificaciones de la tabla de Equipos y Materiales) a intervalos starting desde el tiempo cero (t0 = día de la invasión de ensayo establecido, inmediatamente después del paso 2,10 hasta 72 horas o 96 horas para que invaden las líneas celulares tumorales más lentas. Seleccione la aplicación 'Confluencia'. Compruebe que el esferoide es en el enfoque y, si es necesario, ajustar manualmente y fijar el 'enfoque puesto fuera de'. En 'Ajustes de muestreo', seleccione escanear un campo central de visión (FOV). Después de la adición BMM, esferoides tumorales deberían haber permanecido en una posición central, por lo que no hay necesidad de escanear todo el pozo. En el software, definen los pozos para ser escaneados seleccionándolos en el mapa plato. Haga clic en "Iniciar escaneo". NOTA: El escaneo se guarda automáticamente y se puede revisar más tarde fuera de línea. 4. Análisis automatizado Image Seleccione la aplicación 'Confluencia'. En la pestaña "Análisis", ajuste aplicajustes ación (por ejemplo, "precisión": bajo, alto normal; "umbral de intensidad": 1 – 15) para producir una segmentación precisa alrededor del esferoide, incluidos los procesos celulares y invadopodios extienden en el BMM (ver Figura 1). Ajuste las configuraciones para cada línea de células tumorales y / o en varios puntos de tiempo. Medidas de aplicación El 'Confluence "el% del área bien cubierta por las células invasoras, en el campo de visión seleccionado. Compruebe que los ajustes de análisis son apropiadas (es decir, la segmentación es exacto) para otros esferoides en la placa haciendo clic en un par de pozos diferentes. Si la segmentación no describe con precisión un esferoide, ajustar los parámetros de la aplicación ulterior. Haga clic en "Iniciar análisis". En la pestaña "Resultados", compruebe múltiples pozos para verificar la calidad del análisis. Exportar 'Bien de datos de nivel' a un programa de hoja de cálculo. REPEAanálisis t para todos los puntos de tiempo. Calcule la media% de confluencia para pozos replicados y la invasión de parcela (% de confluencia) contra el tiempo en un gráfico de barras, utilizando gráficas científica y software estadístico de elección. 5. Imagen de Manual de Adquisición Grabar una imagen para cada esferoide tumor a intervalos a partir de t = 0 hasta 72 a 96 horas, dependiendo de la velocidad de la invasión de la línea celular en cuestión, usando un microscopio invertido (para una placa de 96 pocillos esto toma aproximadamente 20 – 30 min). Utilice un objetivo de 10X. Utilice un objetivo 4X cuando un área invadida es demasiado grande para ser capturado completamente dentro del campo de 10X de vista. Guarde cada imagen individual adquirido. Para la calibración, tomar imágenes de una etapa de la retícula (1 mm) utilizando ambos objetivos 10X y 4X (y guardar las imágenes). 6. Análisis de imagen Manual Abra las imágenes etapa retícula en el software de análisis de imágenes de elección. Introduzca el gratmediciones icule, las unidades (micras), los objetivos utilizados (10X o 4X) y llevar a cabo la calibración. Este paso es necesario sólo una vez. Para el análisis de imagen posterior, simplemente volver a cargar los ajustes de calibración requeridas. Abra las imágenes del ensayo de invasión y seleccione los ajustes de calibración en función del objetivo de microscopio (10X o 4X) utilizados para obtener las imágenes. Alternativamente, las imágenes de importación obtenidos en un citómetro de formación de imágenes (paso 3) y analizar manualmente, como se describe para imágenes obtenidas usando un microscopio invertido (ver resultados mostrados en la Figura 3 y la Figura 4). Mida el área cubierta por los esferoides. En el software utilizado aquí por los resultados representativos (para ver las especificaciones de la tabla de Equipos y Materiales), vaya a "Measure" y seleccione "Contar / size '. Elija "Archivo" y luego "Cargar ajustes 'y seleccione predeterminado assaajustes y. A continuación, seleccione 'Contador'. El esferoide debe entonces ser segmentado con precisión. Alternativamente ir a "Editar" y luego "Dibujar / Fusionar objetos 'para abrir la ventana" Varita Mágica / Trace'. Utilice el cursor varita para hacer clic en la imagen esferoide y obtener la segmentación. Seleccione 'Rastro' (en la ventana 'varita mágica') para delinear manualmente el esferoide usando un ratón. Mediciones de exportación de diferentes parámetros (área, diámetro, perímetro etc.) a una hoja de cálculo. Grabar en la hoja de cálculo de la información de la imagen de referencia (por ejemplo, bueno número, punto de tiempo relativo). Trazar el área media de esferoides replicadas (invasión) en función del tiempo utilizando gráficos científica y software estadístico. Alternativamente, calcular el cambio en el área esferoide en cada punto de tiempo, con relación al área en t = 0. Entonces invasión parcela (t0%) frente al tiempo como una gra linealph.

Representative Results

Invasión esferoide tumor 3D se evaluó utilizando un método simple, reproducible y automatizada se ilustra esquemáticamente en la Figura 1: esferoides tumorales reproducible de tamaño se obtienen mediante siembra de células en ULA placas de 96 pocillos de fondo redondo. 4 días después de la iniciación esferoides se incrustan en BMM. Esto proporciona una estructura semi-sólido en el cual las células tumorales invaden y se extienden hacia fuera del esferoide. Esferoides están ubicados en la base de cada pocillo y la invasión en el BMM se controla fácilmente a intervalos a partir de t = 0 hasta 72 a 96 horas utilizando un citómetro de imágenes. Esto puede proporcionar análisis de imágenes totalmente automatizado. Ejemplos de diferentes tipos de invasión de células de cáncer se ilustran en las Figuras 2 -. 4 El glioblastoma multiforme altamente maligno humano (GBM) línea celular U-87 MG, se forma una estructura esférica 3D apretado y se utiliza aquí para ejemplificar los tumores cerebrales en los que locales invasión es mortal una clavecaracterística. Una vez incrustado en BMM, las células de esferoides U-87 MG untadas con un típico "starburst" patrón de invasión 12. Las células tumorales se extienden radialmente en la matriz en la que éstas mantienen una forma 3-dimensional. El proceso es seguido durante un período de 72 horas como se muestra en la Figura 2 para U-87 MG esferoides, cuando la extensión de la invasión de células tumorales, con los detalles de los procesos celulares y invadopodios que se extienden en la BMM es claramente evidente. Totalmente automatizado de análisis de imágenes usando un citómetro de imagen permite la cuantificación exacta de la invasión de células tumorales en el tiempo. Se obtiene la cuantificación en la Figura 2 como se ilustra en la Figura 1, donde el análisis automatizado produce la segmentación alrededor de los salientes de células que se extienden en la BMM de la U-87 MG cuerpo esferoide. Tenga en cuenta que para esta línea celular, el cuerpo esferoide tumor está excluida de la medición de la zona invadida. Un patrón diferente de INVASiones se muestra por las líneas celulares de cáncer de cabeza y cuello escamosas humanos. CAL CAL S y R son isogénicas pero CAL S es sensible a, y CAL R resistentes a los inhibidores de la tirosina quinasa EGFR 14. En ausencia de EGF, ni línea celular invadió en el BMM (Figura 3) Sin embargo, a medida que aumentaba la concentración de EGF (a 2,5 ng / ml), los esferoides parecen 'brote'. A las concentraciones más elevadas de EGF (40 y 80 ng / ml) el grado de invasión se redujo. Esto es coherente con la respuesta a la dosis clásica en forma de campana a EGF en términos de invasión que se ha informado anteriormente 15. En 20 ng / ml EGF, los salientes en forma de dedos extruidos desde el cuerpo principal de esferoides CAL R mientras que las células CAL S eran menos invasiva después de 72 hr (Figura 3). Esta invasión diferencial fue evidente después de 48 hr esferoides fueron colocados en BMM (que contiene 20 ng / ml de EGF para la distinción máxima entre las líneas celulares) Y mayor a las 72 horas (Figura 4). Estas imágenes fueron adquiridas rápidamente usando un citómetro de imágenes, como por U-87 MG. Sin embargo, en este caso, para ejemplificar un método alternativo, el grado de invasión se cuantificó manualmente utilizando el software de análisis de imagen independiente y se presenta gráficamente (figuras 3 y 4). Estos resultados ilustran una diferencia fenotípica entre células sensibles a fármacos y resistentes que podrían ser utilizados para la detección de compuestos que antagonizan específicamente el fenotipo resistente al fármaco, invasivo. Figura 1. Visión general esquemática de ensayo de invasión tumoral esferoide 3D. El flujo de trabajo muestra los pasos del método involucra incluyendo imágenes representativas de esferoides U-87 MG glioblastoma justo después de la incorporación en BMM (panel superior; t = 0) y después de la invasión en BMM (panel inferior; t = 72 hr) con y sin la segmentación que mide el área cubierta por las células invasoras. Bar = 100 micras. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 2. Tiempo-curso de la invasión U-87 MG glioblastoma esferoide en BMM. U-87 MG esferoide invasión 3D en BMM se controló y se cuantifica hasta 72 horas utilizando un citómetro de imágenes. (A) Imágenes representativas y (B) la cuantificación de se muestran invasión de células tumorales. Bar = 500 micras. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. re 3 "src =" / files / ftp_upload / 52686 / 52686fig3.jpg "/> Figura 3. CAL R (resistente) y CAL S (sensible) esferoide invasión tumoral. (A) Imágenes representativas y (B) la cuantificación Manual de EGF dependiente de la dosis CAL R y S CAL invasión tumoral esferoide se muestran. Bar = 500 micras. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 4. Las células de CAL R esferoides (resistentes) son más invasivas que CAL S (sensibles) esferoides tumorales cuando se coloca en BMM. Al FEAG estimulación CAL R esferoides tumorales muestran una invasión más pronunciada que CAL S. (A) Imágenes representativas y (B) la cuantificación manual de la invasión se muestran. Bar = 500 micras. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discussion

Los dos modelos de tumores descritos aquí (glioblastoma y CECC) fueron seleccionados específicamente para ejemplificar nuestro ensayo en 3D, ya que son clínicamente cánceres invasivos localmente relevantes con una necesidad insatisfecha de terapias efectivas 12. Después del tratamiento de drogas, la evaluación in vitro de cambios farmacodinámica (PD) de biomarcadores se pueden realizar fácilmente por Western blot o inmunoensayos de lisados ​​tras el uso de reactivos disponibles en el mercado específicas para permitir la recuperación de células de BMM y / o análisis de inmunofluorescencia de invadir esferoides tumorales por toda tinción de montaje.

Este ensayo de invasión es una técnica útil para la evaluación rápida y reproducible de invasión de células tumorales en un medio semisólido y por lo tanto particularmente apropiado para el futuro en la detección de drogas vitro. Las células cancerosas invaden la matriz de una manera 3D medida que se extienden hacia fuera de un "micro-tumor", representada por el esferoide tumor, y se extienden en una extracellulentorno de matriz ar. La verdadera tridimensionalidad del ensayo es evidente en la morfología celular, que es diferente de la, morfología adherente plana células suponen cuando se mueve sobre un sustrato sólido. El grado de invasión se cuantifica fácilmente usando un citómetro de formación de imágenes, lo que permite una lectura de automatizado, o mediante el uso de un microscopio estándar en combinación con software de imágenes. Además, este método es adecuado para la formación de imágenes fluorescentes 13 (por ejemplo con líneas celulares que expresan proteínas fluorescentes o pre-marcada con colorantes fluorescentes).

El método es fácil de realizar con el único paso crítico representado por la adición de la BMM, cuando hay un riesgo de perturbar la posición central de la esferoide en la forma de U también. Esto puede resultar en análisis de imagen subóptima, con esferoides en diferentes planos focales. Por tanto, es crítico para añadir el BMM con cuidado y lentamente a cada pocillo. Después de la adición BMM es recomendable comprobar la placabajo un microscopio y si la localización se considera inaceptable, esto se puede remediar por centrifugación suave. Con la experiencia, esto es raramente necesario. Si bien este método es robusto y muy reproducible, la variación inter-experimental podría ocurrir con diferentes lotes de BMM. Para evitar esto, es recomendable adquirir suficiente BMM de un solo lote para completar una serie de estudios.

Una limitación del método (como por cualquiera de estos ensayos) es la dificultad de distinguir entre la invasión y proliferación, que las células tumorales se someten probable durante el marco de tiempo de ensayo. Aunque el tiempo de duplicación de las células puede ser tomado en cuenta, o inhibidores del ciclo celular tales como citocalasina D introdujo, no es fácil de controlar o claramente distinguir entre estos dos aspectos diferentes de la progresión del tumor, especialmente para las células tumorales de crecimiento rápido y para aquellos que tener un patrón de invasión más "expansiva", en lugar de infiltrante. Por esta razónse sugiere que un ensayo de crecimiento 3D paralelo se lleva a cabo para evaluar los efectos concretos de los agentes inhibidores o estimulantes. Si se realizan estudios de respuesta de dosis cuidadoso, puede ser posible seleccionar concentraciones que minimicen efectos sobre la proliferación. Por ejemplo, hemos demostrado que el inhibidor de HSP90 17-AAG inhibe U-87 MG 3D invasión esferoide tumor ya a las 24 horas y a concentraciones por debajo de la concentración que inhibe el crecimiento 3D en un 50% (GI 50) 12.

Por otra parte, la importancia de este ensayo en comparación con otros ensayos de invasión estándar (por ejemplo, filtro basado en ensayos o invasión de células individuales en matrices 3D 1), es que las células tumorales invaden la matriz circundante desde el esferoide, que se asemeja a una " micro-tumor "o un" micro-metástasis ", y por lo tanto tiene en cuenta los aspectos importantes de la patofisiología de una masa tumoral. El método que presentamos proporciona información sobre lacomportamiento colectivo de las células tumorales, al salir inicialmente los esferoides, y también individualmente, cuando las células individuales llegan a regiones más distantes en el BMM. Además, las células dentro de esferoides tumorales pueden experimentar hipoxia y nutrientes privación que, a través de cambios en la expresión génica, puede promover la migración y la invasión; tales características están ausentes en los ensayos de 2D. Además, todo esto está disponible en un formato de alto rendimiento mediante el uso de placas de 96 pocillos específicos y la última tecnología de imagen, lo que permite un ensayo de 3D más complejo para ser utilizado fácilmente en la validación de dianas y el descubrimiento de fármacos.

El método que presentamos tiene capacidad para otras aplicaciones para abordar aspectos adicionales de la invasión de las células tumorales. En particular, la complejidad adicional puede preverse por la adición de células huésped, tales como los fibroblastos y / o células endoteliales, en el esferoide en sí o la matriz circundante. Esto también puede ser modificado, no sólo en términos de rigidez (por el uso de diferentes concentrations de BMM), sino también en términos de composición (por la adición de otros componentes que dependen del tejido / órgano específico del modelo adoptado tumor: por ejemplo, tenascina para los cánceres cerebrales 16 y colágeno para el carcinoma de mama 17).

Una similares set-up (generación de esferoides y de formación de imágenes) también se pueden adaptar para evaluar la invasión de tejidos en 3D, donde esferoides tumorales son co-cultivadas con cuerpos embrioides se asemejan a un tejido complejo 12 o con otros organoides de células específicas (por ejemplo, astrocitos para culturas glioma 18 o criptas para los cánceres gastrointestinales), pero más trabajo se requiere para permitir el análisis de imágenes automatizado.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work was funded by The National Centre for the Replacement, Refinement and Reduction of Animals in Research (G1000121 ID no.94513) and the Oracle Cancer Trust. SE is supported by The Institute of Cancer Research and Cancer Research UK (grant number C309/A8274). We acknowledge NHS funding to the NIHR Biomedical Research Centre.

Materials

Name of Reagent/ Equipment Company Catalog Number Web address
Corning Matrigel Basement Membrane Matrix Corning 354234 http://www.corning.com
Keep at  4 °C to  prevent solidification and dispense using cooled pipette tips
Cultrex Basement Membrane Extract, PathClear Trevigen 3432-005-01 http://www.trevigen.com
Keep at  4 °C to  prevent solidification and dispense using cooled pipette tips
Ultra-low attachment 96-well plate Corning 7007 http://www.corning.com
EGF Miltenyi Biotec 130-093-825 http://www.miltenyibiotec.com
Add 100 µl 1% BSA (w/v) in water to 100 µg EGF. To 25 µl of this, add 4,975 µl RHB-A medium to give a 10 µg/ml working stock. Aliquot and store at -20ºC
RHB-A medium Stem Cells Inc. SCS-SF-NB-01 http://www.stemcellsinc.com
For diluting EGF
DMEM GIBCO 31966-021 http://www.lifetechnologies.com/
Warm in 37 °C waterbath before use
Fetal Bovine Serum Biosera 1001/500 http://www.biosera.com
Heat at 56 °C to inactivate complement before use
TrypLE GIBCO 12605 http://www.lifetechnologies.com/
Cell dissociation solution
Celigo cytometer Nexcelom Bioscience n/a http://www.nexcelom.com
Specialist equipment for image capture and analysis.  Manual image capture by microscopy and independent image analysis software is an alternative
IX70 inverted microscope Olympus n/a http://www.olympus.co.uk/
Used with camera for manual image capture
Retiga Exi Fast 1394 digital camera Qimaging n/a http://www.qimaging.com/
Attached to microscope for manual image capture
Image-Pro Plus 7.0 Media Cybernetics n/a http://www.mediacy.com/
Software used to control camera and microscope for manual image capture
Image-Pro Analyzer 7.0 Media Cybernetics n/a http://www.mediacy.com/
Stand-alone image analysis software for manual measurment of spheroid size
Excel 2010 Microsoft n/a http://www.microsoft.com/
Scientific graphing and statistical software
Prism 6.0 GraphPad n/a http://www.graphpad.com/
Scientific graphing and statistical software
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References

  1. Astashkina, A., Mann, B., Grainger, D. W. A critical evaluation of in vitro cell culture models for high-throughput drug screening and toxicity. Pharmacology & therapeutics. 134 (1), 82-106 (2012).
  2. Zimmermann, M., Box, C., Eccles, S. Two-Dimensional vs. Three-Dimensional In Vitro Tumor Migration and Invasion Assays. Methods and Protocols. 986, 227-252 (2013).
  3. Hwang, Y. S., Park, K. K., Chung, W. Y. Invadopodia formation in oral squamous cell carcinoma: the role of epidermal growth factor receptor signalling. Arch. Oral. Biol. 57 (4), 335-343 (2012).
  4. Wang, S., et al. Study on invadopodia formation for lung carcinoma invasion with a microfluidic 3D culture device. PLoS One. 8 (2), e56448 (2013).
  5. Friedl, P., Alexander, S. Cancer invasion and the microenvironment: plasticity and reciprocity. Cell. 147 (5), 992-1009 (2011).
  6. Brekhman, V., Neufeld, G. A novel asymmetric 3D in-vitro assay for the study of tumor cell invasion. BMC Cancer. 9, 415 (2009).
  7. Kleinman, H. K., Martin, G. R. Matrigel: basement membrane matrix with biological activity. Semin. Cancer Biol. 15 (5), 378-386 (2005).
  8. Boyden, S. The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes. J. Exp. Med. 115, 453-466 (1962).
  9. Nystrom, M. L., et al. Development of a quantitative method to analyse tumour cell invasion in organotypic culture. The Journal of pathology. 205 (4), 468-475 (2005).
  10. Deisboeck, T. S., et al. Pattern of self-organization in tumour systems: complex growth dynamics in a novel brain tumour spheroid model. Cell Prolif. 34 (2), 115-134 (2001).
  11. Harma, V., et al. A comprehensive panel of three-dimensional models for studies of prostate cancer growth, invasion and drug responses. PLoS One. 5 (5), e10431 (2010).
  12. Vinci, M., et al. Advances in establishment and analysis of three-dimensional tumor spheroid-based functional assays for target validation and drug evaluation. BMC Biol. 10, 29 (2012).
  13. Vinci, M., Zimmermann, M., Box, C., Eccles, S. Tumor spheroid-based migration assays for evaluation of therapeutic agents. Methods and Protocols. , 253-266 (2013).
  14. Box, C., et al. A novel serum protein signature associated with resistance to epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitors in head and neck squamous cell carcinoma. Eur. J. Cancer. 49 (11), 2512-2521 (2013).
  15. Khajah, M. A., Al Saleh, S., Mathew, S., M, P., Luqmani, Y. A. Differential effect of growth factors on invasion and proliferation of endocrine resistant breast cancer cells. PLoS One. 7 (7), e41847 (2012).
  16. Brosicke, N., van Landeghem, F. K., Scheffler, B., Faissner, A. Tenascin-C is expressed by human glioma in vivo and shows a strong association with tumor blood vessels. Cell and tissue research. 354 (2), 409-430 (2013).
  17. Cheung, K. J., Gabrielson, E., Werb, Z., Ewald, A. J. Collective invasion in breast cancer requires a conserved basal epithelial program. Cell. 155 (7), 1639-1651 (2013).
  18. Molina, J. R., Hayashi, Y., Stephens, C., Georgescu, M. M. Invasive glioblastoma cells acquire stemness and increased Akt activation. Neoplasia. 12 (6), 453-463 (2010).

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3D Tumor SpheroidInvasion AssayCancerGlioblastomaSquamous Cell CarcinomaEGFRMatrix InvasionDrug ScreeningImage Analysis

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Vinci, M., Box, C., Eccles, S. A. Three-Dimensional (3D) Tumor Spheroid Invasion Assay. J. Vis. Exp. (99), e52686, doi:10.3791/52686 (2015).
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