Invasion of surrounding normal tissues is a defining characteristic of malignant tumors. We provide here a simple, semi-automated micro-plate assay of invasion into a natural 3D biomatrix that has been exemplified with a number of models of advanced human cancers.
Invasion av omgivande normala vävnader anses allmänt vara en viktig kännetecken för maligna (i motsats till benigna) tumörer. För vissa cancerformer i synnerhet (t.ex. hjärntumörer såsom glioblastoma multiforme och skivepitelcancer i huvud och hals -. SCCHN) är en orsak till allvarlig sjuklighet och kan vara livshotande, även i avsaknad av fjärrmetastaser. Dessutom cancer som fått återfall efter behandling tyvärr ofta närvarande med en mer aggressiv fenotyp. Därför finns det en möjlighet att rikta processen för invasionen att tillhandahålla nya behandlingar som kan vara komplementär till schablon antiproliferativa medel. Hittills har denna strategi hämmats av bristen på robusta, reproducerbara analyser som lämpar sig för en detaljerad analys av invasionen och för drogscreening. Här ger vi en enkel mikro-platta (baserat på en enhetlig, självorganiserande 3D tumör sfäroider) som har en stor potential för en sådan studör. Vi exemplifierar analysplattform med hjälp av en mänsklig glioblastomcellinje och även en SCCHN modell där utvecklingen av resistens mot riktade epidermal tillväxtfaktorreceptor (EGFR) -hämmare förknippas med förbättrad matris invasiv potential. Vi erbjuder också två alternativa metoder för halvautomatisk kvantifiering: en med hjälp av en avbildning cytometer och en andra som helt enkelt kräver standard mikroskopi och ta bilder med digital bildanalys.
Klassisk cancer läkemedelsutveckling är till stor del inriktad på användningen av in vitro cellbaserade analyser för att screena för cytotoxiska medel som hämmar tumörcelltillväxt och / eller främja programmerad celldöd (apoptos). På senare tid har arbetet gått mot riktade behandlingar med utvecklingen av hämmare av de bakomliggande molekylära orsakerna till malign celltillväxt. Trots några spektakulära resultat, är sådana medel som ofta förknippas med den snabba utvecklingen av läkemedelsresistens. Med tanke på att det är invasiva och metastatisk potential av tumörceller som är ansvarig för de flesta dödsfall i cancer, och att återfall sjukdom uppvisar ofta en mer aggressiv fenotyp, är det logiskt också att överväga kompletterande in vitro experimentella modeller 1,2 för att identifiera nya medel som kommer att hämma dessa extra viktiga "kännetecken" av cancer.
Under malign progression, tumörceller förvärvaförmågan att invadera omgivande vävnad och / eller spridas till avlägsna organ (metastaser). Cancerceller penetrera basalmembranet genom bildning av invadopodia 3,4. Dessa strukturer är berikad med aktinfilament, specifika vidhäftningsproteiner och proteinaser och är kollektivt ansvariga för tumör cellmotilitet och nedbrytning av den extracellulära matrisen (ECM) 5. Invadopodia sträcker sig in i ECM och tros vara viktiga för tumörcellinvasion och även extravasering i kärl kanaler, vilket underlättar hematogen (eller lymfatiska) spridning och metastasering.
Nuvarande standardmetoder för att utvärdera tumörcellinvasion in vitro inkluderar följande. Transwell-baserad eller Boyden kammaranalyser 2,6 där enkelcellsuspensioner ympas ovanpå ett filter belagt med ett tjockt skikt av ECM-härledda proteiner. Celler invaderar sedan och flytta in i den nedre kammaren som svar på en kemo-attraherande. Vanligen använda ECMproteiner är typ I-kollagen, eller ett basalmembran-liknande matris (BMM, t.ex., Matrigel, som härrör från EHS-tumör 7) som härmar den naturliga sammansättningen av basalmembran.
Som ett alternativ till de filterbaserade Boyden-kammare typ analyser 8 kan celler ympas ovanpå en ECM-gel (till vilka fibroblaster kan tillsättas), där de bildar ett monoskikt och sedan individuellt eller kollektivt invadera in i gelén. Invasion kan mätas i termer av antalet invaderande celler och / eller avståndet reste från gelytan 9. Tumörceller kan också vara helt inbäddad i en matris, antingen som en enkelcellsuspension eller som sfäroider – vanligen placerade mellan två skikt av ECM-gel- tillåter celler att invadera ur tumörmassan i den omgivande matrisen 2,6,10,11.
Det tredimensionella (3D) tumör sfäroid invasionsanalys som beskrivs här ger en snabb, automatiserbar invasionen system med användning av en highly reproducerbar, standardiserad metod 12 i en 96-brunnar format med en sfäroid per brunn. BMM tillsätts direkt till varje brunn för att ge en halvfast matris, i vilken tumörceller invaderar från sfäroid kropp. Graden av tumörcellinvasion övervakas vid intervall över en period av 72-96 timmar. Denna metod har följande fördelar jämfört med den nuvarande in vitro invasionsanalyser som nämns ovan: Tumörcellerna är organiserade i en 3D-struktur härma en tumör mikro region eller en mikro metastas; tumör sfäroiderna är mycket reproducerbara i storlek; invasionen analysen utförs på plats i samma platta som tumör sfäroid utveckling, utan att behöva flytta dem till sekundära plattor; metoden, i kombination med den senaste tekniken för automatisk bildanalys möjliggör både hög halt och hög kapacitet analyser av tumörcellinvasion.
Den bildanalys utförs med användning av en bildgivande cytometer, som skannar en 96-brunnarsplattan inom 10 minuter. Genom att använda sammanflödet ansökan, omfattningen och hastigheten av invasionen uppnås antingen genom enstaka celler eller genom cellkluster sprider ut från tumör sfäroiderna och invaderande in i matrisen kan mätas på ett dynamiskt sätt. För lägre genomströmning, är en alternativ metod för bildanalys presenteras, baserad på användningen av ett inverterat mikroskop och standard bildprogram.
De två tumörmodeller som beskrivs här (glioblastom och SCCHN) var speciellt utvalda för att exemplifiera vår 3D-analys eftersom de är kliniskt relevanta lokalt invasiv cancer med ett icke tillgodosett behov av effektiva behandlingar 12. Efter läkemedelsbehandling, bedömning av in vitro farmakodynamiska (PD) biomarkörer förändringar kan göras enkelt genom western blöt eller immun av lysat efter användning av särskilda kommersiellt tillgängliga reagens för att tillåta cell återhämtning från BMM och / eller immunofluorescerande analys av invaderande tumör sfäroider genom hela mount färgning.
Denna invasion analys är en användbar teknik för snabb och reproducerbar bedömning av tumörcellinvasion i ett halvfast medium och därför särskilt lämplig för framtiden läkemedel vitro screening. Cancerceller invadera matrisen i en 3D sätt som de sprider ut från en "mikro-tumör", företrädd av tumören sfäroid, och sträcker sig in i en extracellular matrisliknande miljö. Den sanna tredimensionalitet av analysen är uppenbar i cellmorfologin, som skiljer sig från den platta, vidhäftande morfologi celler antar när du flyttar på ett fast substrat. Graden av invasionen är lätt kvantifieras med hjälp av antingen en avbildning cytometer, vilket gör att en automatiserad utläsning, eller genom att använda en standardmikroskop i kombination med bildbehandlingsprogram. Dessutom är denna metod lämplig för fluorescerande avbildning 13 (till exempel med cellinjer som uttrycker fluorescerande proteiner eller pre-märkta med fluorescerande färgämnen).
Metoden är enkel att utföra med den enda kritiska steget representeras av tillsatsen av BMM, när det finns en risk för att störa den centrala positionen för sfäroid i den U-formade väl. Detta kan resultera i suboptimal bildanalys, med sfäroider i olika fokalplan. Det är därför avgörande att lägga BMM försiktigt och långsamt till varje brunn. Efter BMM Dessutom är det lämpligt att kontrollera plattanunder ett mikroskop och om lokaliseringen anses oacceptabel, kan detta avhjälpas genom försiktig centrifugering. Med erfarenhet, är detta sällan nödvändigt. Även om denna metod är robust och mycket reproducerbar, kan inter experimentell variation uppträda med olika satser av BMM. För att undvika detta, är det lämpligt att köpa tillräckligt BMM från en enda sats för att slutföra en rad studier.
En begränsning av metoden (som för sådana analyser) är svårigheten att skilja mellan invasion och spridning, vilket tumörcellerna genomgår sannolikt under analysen tidsramen. Även kan tas fördubblingstiden för celler hänsyn eller cellcykelinhibitorer såsom cytochalasin D infördes, är det inte lätt att kontrollera eller tydligt skilja mellan dessa två olika aspekter av tumörprogression, särskilt för snabbväxande tumörceller och för dem som har en mer "expansiv", snarare än infiltrativ, invasion mönster. Av denna anledningDet föreslås att en parallell 3D tillväxtanalys genomförs för att utvärdera specifika effekterna av eventuella hämmande eller stimulerande medel. Om noggrann dos-responsstudier har utförts, kan det vara möjligt att välja koncentrationer som minimerar effekterna på proliferation. Till exempel har vi visat att HSP90 hämmare 17-AAG hämmar U-87 MG 3D tumör sfäroid invasionen redan vid 24 timmar och vid koncentrationer under koncentrationen hämma 3D tillväxt med 50% (GI 50) 12.
Å andra sidan, betydelsen av denna analys jämfört med andra standard invasionsanalyser (t.ex. filterbaserade analyser eller invasion av enskilda celler i 3D matriser 1), är att tumörceller invaderar in i den omgivande matrisen från sfäroid, som liknar en " mikro-tumör "eller en" mikro-metastas ", och därför tar hänsyn till viktiga aspekter av patofysiologin för en tumörmassa. Den metod som vi presenterar ger information omkollektiva beteendet hos tumörceller, när initialt lämnar sfäroiderna, och även individuellt, när enstaka celler nå mer avlägsna regioner i BMM. Dessutom kan celler i tumör sfäroider uppleva hypoxi och närings berövande som, genom förändringar i genuttryck kan främja migration och invasion; dessa aspekter är frånvarande i 2D analyser. Dessutom är allt detta finns i en hög genomströmning format genom användning av särskilda plattor med 96 brunnar och den senaste bildteknik, vilket gör att en mer komplex 3D-analys för att lätt kunna användas i målvalidering och läkemedelsutveckling.
Den metod vi presenterar kan rymma ytterligare ansökningar för att ta itu med ytterligare aspekter av tumörcellinvasion. I synnerhet kan extra komplexitet införas genom tillsats av värdceller, såsom fibroblaster och / eller endotelceller, in i sfäroid själv eller den omgivande matrisen. Detta kan också ändras, inte bara i termer av styvhet (genom användning av olika concentrations av BMM), men också när det gäller komposition (genom tillsats av andra komponenter beroende på den specifika vävnaden / organet i det antagna tumörmodell: t.ex. tenascin för hjärncancer 16 och kollagen för bröstkarcinom 17).
En liknande upplägg (generation sfäroider och imaging) kan också anpassas för att bedöma vävnadsinvasion i 3D, där tumör sfäroider är samodlade med embryoidkroppar liknar en komplex vävnad 12 eller med andra cellspecifika organoids (t.ex. astrocyter för gliom 18 eller crypt kulturer för gastrointestinal cancer) men det krävs ytterligare arbete för att möjliggöra automatiserad bildanalys.
The authors have nothing to disclose.
This work was funded by The National Centre for the Replacement, Refinement and Reduction of Animals in Research (G1000121 ID no.94513) and the Oracle Cancer Trust. SE is supported by The Institute of Cancer Research and Cancer Research UK (grant number C309/A8274). We acknowledge NHS funding to the NIHR Biomedical Research Centre.
Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Web address |
Corning Matrigel Basement Membrane Matrix | Corning | 354234 | http://www.corning.com Keep at 4 °C to prevent solidification and dispense using cooled pipette tips |
Cultrex Basement Membrane Extract, PathClear | Trevigen | 3432-005-01 | http://www.trevigen.com Keep at 4 °C to prevent solidification and dispense using cooled pipette tips |
Ultra-low attachment 96-well plate | Corning | 7007 | http://www.corning.com |
EGF | Miltenyi Biotec | 130-093-825 | http://www.miltenyibiotec.com Add 100 µl 1% BSA (w/v) in water to 100 µg EGF. To 25 µl of this, add 4,975 µl RHB-A medium to give a 10 µg/ml working stock. Aliquot and store at -20ºC |
RHB-A medium | Stem Cells Inc. | SCS-SF-NB-01 | http://www.stemcellsinc.com For diluting EGF |
DMEM | GIBCO | 31966-021 | http://www.lifetechnologies.com/ Warm in 37 °C waterbath before use |
Fetal Bovine Serum | Biosera | 1001/500 | http://www.biosera.com Heat at 56 °C to inactivate complement before use |
TrypLE | GIBCO | 12605 | http://www.lifetechnologies.com/ Cell dissociation solution |
Celigo cytometer | Nexcelom Bioscience | n/a | http://www.nexcelom.com Specialist equipment for image capture and analysis. Manual image capture by microscopy and independent image analysis software is an alternative |
IX70 inverted microscope | Olympus | n/a | http://www.olympus.co.uk/ Used with camera for manual image capture |
Retiga Exi Fast 1394 digital camera | Qimaging | n/a | http://www.qimaging.com/ Attached to microscope for manual image capture |
Image-Pro Plus 7.0 | Media Cybernetics | n/a | http://www.mediacy.com/ Software used to control camera and microscope for manual image capture |
Image-Pro Analyzer 7.0 | Media Cybernetics | n/a | http://www.mediacy.com/ Stand-alone image analysis software for manual measurment of spheroid size |
Excel 2010 | Microsoft | n/a | http://www.microsoft.com/ Scientific graphing and statistical software |
Prism 6.0 | GraphPad | n/a | http://www.graphpad.com/ Scientific graphing and statistical software |