Summary

Long Term Intravital Multiphoton Microscopia de imagem de células imunes no saudáveis ​​e doentes do fígado por meio CXCR6.Gfp Reporter Mice

Published: March 24, 2015
doi:

Summary

Stable intravital high-resolution imaging of immune cells in the liver is challenging. Here we provide a highly sensitive and reliable method to study migration and cell-cell-interactions of immune cells in mouse liver over long periods (about 6 hours) by intravital multiphoton laser scanning microscopy in combination with intensive care monitoring.

Abstract

Inflamação do fígado como uma resposta à lesão é um processo altamente dinâmico envolvendo a infiltração de subtipos distintos de leucócitos incluindo monócitos, neutrófilos, subconjuntos de células T, células B, células assassinas naturais (NK) e as células NKT. Microscopia intravital do fígado para monitorar a migração de células imunes é particularmente desafiador devido às altas exigências em matéria de preparação de amostras e fixação, resolução óptica e sobrevivência dos animais no longo prazo. No entanto, a dinâmica dos processos inflamatórios, assim como estudos de interacção celular poderia fornecer informações importantes para compreender melhor o início, a progressão e regressão da doença inflamatória do fígado. Portanto, um método altamente sensível e confiável foi criada para estudar a migração e célula-célula-interações de células imunes diferentes em fígado de rato durante longos períodos (cerca de 6 h) por dois fótons de microscopia de varredura a laser intravital (TPLSM) em combinação com tratamento intensivo monitorização.

ent "> O método fornecido inclui uma preparação suave e fixação estável do fígado com perturbação mínima do órgão; imagiologia intravital longo prazo usando microscopia multiphoton multicolor com praticamente nenhuma fotodegradação ou efeitos fototóxicos, durante um período de até 6 horas, permitindo rastreamento de subconjuntos de leucócitos específicos; e condições de imagem estável devido à ampla fiscalização do rato parâmetros vitais e estabilização da circulação, temperatura e troca gasosa.

Para investigar a migração de linfócitos após a inflamação do fígado CXCR6.gfp ratinhos knock-in foram submetidos a imagiologia do fígado intravital em condições basais e após os danos do fígado aguda e crónica induzida por injecção intraperitoneal (s) de tetracloreto de carbono (CCl 4).

CXCR6 é um receptor de quimiocina expressa em linfócitos, principalmente em Natural T assassinas (NKT) -, Natural Killer (NK) – e subconjuntos de linfócitos T, tais como células T CD4 +, mas também asso mucosasated invariante células (MAIT) T 1. Seguindo o padrão migratório e posicionamento de CXCR6.gfp + células imunes permitiu uma visão detalhada sobre o seu comportamento alterado após a lesão hepática e, portanto, o seu potencial envolvimento na progressão da doença.

Introduction

A visualização de células e as funções celulares em órgãos inteiros ou até mesmo de organismos inteiros tem sido de grande interesse para mais de 50 anos, incluindo praticamente todas as partes do corpo 2. Por isso, alguns estudos iniciais já empregaram imagens intravital do fígado 3,4. No entanto, existem várias limitações atualizado sobre estável imagens de alta resolução a longo prazo do tecido do fígado.

Devido à posição anatómica do fígado em estreito contacto com o diafragma e o tracto gastrointestinal 5, o problema mais comum para imagiologia intravital microscópica é o movimento devido à respiração e, em menor grau, peristáltica do tracto intestinal 6. Em comparação com outros órgãos sólidos, cirurgia do fígado é particularmente desafiador. Devido à estrutura microvascular densa, manipulação cirúrgica pode conduzir a lesões hemorrágicas maciças, microcirculação comprometida 7 e também a activação de residente immune células, tais como células de Kupffer 8. Portanto, a fixação mecânica do tecido como publicado anteriormente 6,9 é susceptível de interferir com a imagem de microscopia intravital.

Em um fígado saudável, 10-15% do volume total de sangue reside dentro da vasculatura hepática, e o órgão recebe cerca de 25% do débito cardíaco geral 10, tornando o órgão altamente susceptíveis a mudanças na circulação (por exemplo, flutuações de pressão arterial ). Portanto, as interrupções no fluxo sanguíneo hepático devido, por exemplo, tensão de cisalhamento, deslocamento, lesão por manuseio excessivo dos tecidos ou circulação centralizada vai levar a alterações artificiais no comportamento migratório de leucócitos, deficiente oxigenação fígado e, portanto, mais danos ao fígado, afetando as respostas imunes do fígado, bem como preservação de órgãos e tempo de vida total do animal.

Os primeiros estudos microscópicos foram baseados em mi epifluorescência intravitalcroscopy, mas várias restrições técnicas, tais como o branqueamento foto e baixa profundidade de penetração limitar o uso desta técnica para imagiologia do fígado a longo prazo 4,11,12. Com o desenvolvimento da microscopia multiphoton na década de 1990, as limitações de branqueamento foto ou profundidade de penetração foram principalmente resolvido, já que este novo método era tecnicamente capaz de realizar estudos de imagem em praticamente todos os órgãos em situações da vida real 13-15. No entanto, os principais desafios que subsistem no que diz respeito à geração de imagens de fígado foram: movimentos de respiração, autofluorescência do tecido do fígado, protegendo o fluxo sanguíneo inalterado nos sinusóides hepáticos, e de imagem especialmente estáveis ​​por longos períodos de várias horas 16.

Apesar de vários estudos abordaram a função e migração de vários leucócitos no fígado 17, por exemplo, a NKT células-18-20, células T 21,22, os macrófagos do fígado 23,24 ou neutrófilos 25, a longo prazo multiphoton mimaging icroscopy ainda não tinha sido estabelecida com sucesso, uma tarefa ainda mais difícil em animais com doença hepática aguda ou crônica devido ao dano existente e, portanto, maior susceptibilidade a danos maiores 26. No entanto, monitorando o comportamento migratório e função celular de leucócitos no fígado em tempo real, permite que novas idéias em seu papel especial na homeostase do fígado e doença 27.

O receptor de quimiocina CXCR6 é expresso em vários subconjuntos de linfócitos, incluindo células assassinas naturais (NK), as células NKT e algumas populações de células T 18,28. Estudos anteriores em ratos indicaram que CXCR6 e sua CXCL16 ligando cognato pode controlar o patrulhamento de células NKT em sinusóides hepáticos durante a homeostase. Por conseguinte, a utilização de ratinhos CXCR6.gfp (transportando um knock-in de proteína fluorescente verde [GFP] no locus CXCR6) tem sido descrita para investigar a migração de linfócitos em vários órgãos tais como o cérebro 29e também fígado 18,20, mostrando aumento da infiltração de células CXCR6.gfp sobre a inflamação.

Com o método proporcionado no presente estudo foi possível seguir estes processos durante um longo período de tempo sob condições estabilizadas. O procedimento baseado multiphoton intravital permitido de imagem que foi altamente reprodutível com perturbação mínima do animal e do órgão; otimizado para a sobrevivência dos animais a longo prazo através de monitoramento extensa, seguida de perto o controle da respiração e circulação; e altamente flexível e fácil de adoptar igualmente para outros órgãos parenquimatosos, tais como de rim ou baço.

Protocol

NOTA: Os experimentos foram realizados em conformidade com a legislação alemã que rege os estudos em animais após o 'Guia para o cuidado e uso de animais de laboratório "(publicação NIH, 8ª edição, 2011) e da Directiva 2010/63 / UE relativa à protecção dos animais utilizados para fins científicos (Jornal Oficial da União Europeia, 2010). Permissão oficial foi concedida a partir do cuidado com os animais e uso de escritório governamental (LANUV Nordrhein-Westfalen, Recklinghausen, Alemanha). </p…

Representative Results

Para validar nossa abordagem TPLSM intravital, nós submetido GFP / + camundongos CXCR6 a imagem TPLSM intravital. Os ratos foram quer deixados sem tratamento como controlos de linha de base ou submetido a uma única injecção intraperitoneal de tetracloreto de carbono (CCl 4) para induzir danos no fígado aguda 20. As sequências de vídeo foram tomadas ao longo de um período de tempo de 2-5 horas, e as células foram traçadas ao longo do tempo, devido à…

Discussion

O objetivo do nosso estudo foi desenvolver um método altamente padronizada, estável e reprodutível para a imagem latente TPLSM intravital do fígado. Imaging Intravital em geral deu informações valiosas sobre o comportamento celular sob condições reais seguintes homing e interação de diferentes populações de leucócitos em desenvolvimento, a homeostase e da doença. No entanto, a posição anatómica um pouco difícil de fígado, devido a que movimento respiratório e intestinal peristáltica são transmitido…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

The authors thank the Central Animal facility of the University Hospital Aachen for technical support. This work was supported by the German Research Foundation (DFG Ta434/2-1, DFG SFB/TRR 57) and by the Interdisciplinary Center for Clinical Research (IZKF) Aachen. This work was further supported by the Core Facility ”Two-Photon Imaging”, a Core Facility of the Interdisciplinary Center for Clinical Research (IZKF) Aachen within the Faculty of Medicine at RWTH Aachen University.

Materials

Anesthetics
Buprenorphine Essex Pharma 997.00.00 Analgeticum, 0.1 mg/kg
Fentanyl Rotex Medica charge: 30819
Fluovac anesthesia system Harvard Apparatus 34-1030
Glucose 5% Braun
ISOFLO (Isoflurane Vapor) vaporiser Eickemeyer 4802885
Isoflurane Forene Abbott B 506
Isotonic (0.9%) NaCl solution DeltaSelect GmbH PZN 00765145
Ketamin 10% ceva Charge: 36217/09
Xylazin 2% medistar Charge: 04-03-9338/23
Consumable supplies
20ml Syringe BD Plastipak
250ml Erlenmeyer flask Schott Duran 21 226 36
25mL Beaker 2x Schott Duran 50-1150
2ml syringe BD Plastipak
4-0 Vicryl suture Ethicon V7980
Agarose commercially available
Bepanthen Eye and Nose ointment Bayer Vital GmbH 6029009.00.00
Change-A-Tip Deluxe High-Temp Cautery Kit Fine Science Tools Inc. 18010-00
Cotton Gauze swabs Fuhrmann GmbH 32014
Cover Slip 24x50mm ROTH 1871
Durapore silk tape 3M 1538-1
Feather disposable scalpel Feather 02.001.30.011
Fine Bore Polythene Tubing 0,58mm ID Smiths medical 800/100/200
Histoacryl Braun 1050052 5x 0,5ml
Leukoplast BSN Medical Inc.
Microscope Slides ROTH 1879
Poly-Alcohol Haut…farblos Antisepticum Antiseptica GmbH 72PAH200
Sterican needle 18 G x 1 B. Braun 304622
Sterican needle 27 3/4 G x 1 B. Braun 4657705
Tissue paper commercially available
Surgical Instruments
Amalgam burnisher 3PL Gatz 0110?
Blair retractors (4 pronged (blunt)) x2 Storz&Klein S-01134
Dumont No.7 forceps Fine Science Tools Inc. 91197-00
Graefe forceps curved x1 Fine Science Tools Inc. 11151-10
Graefe forceps straight x2 Fine Science Tools Inc. 11050-10
Heidemann spatula HD2 Stoma 2030.00
Needle holder Mathieu Fine Science Tools Inc. 12010-14
Scissor Fine Science Tools Inc. 14074-11
Semken forceps Fine Science Tools Inc. 11008-13
Small surgical scissors curved Fine Science Tools Inc. 14029-10
Small surgical scissors straight Fine Science Tools Inc. 14028-10
Standard pattern forceps Fine Science Tools Inc. 11000-12
Vannas spring scissors Fine Science Tools Inc. 15000-08
Equipment
ECG Trigger Unit Rapid Biomedical 3000003686
MICROCAPSTAR End-Tidal Carbon Dioxide Analyzer AD Instruments
Minivent Typ 845 Harvard Apparatus 73-0043
Multiphoton microscope Trimscope I LaVision
Perfusor Compact B. Braun
PowerLab 8/30 8 channel recorder AD Instruments PL3508
Temperature controlled heating pad Sygonix 26857617
Temperature sensor comercially available
Temperature controlled System for Microscopes -Cube&Box Life Imaging Services

References

  1. Dusseaux, M., et al. Human MAIT cells are xenobiotic-resistant, tissue-targeted, CD161hi IL-17-secreting T cells. Blood. 117 (4), 1250-1259 (2011).
  2. Reese, A. J. The effect of hypoxia on liver secretion studied by intravital fluorescence microscopy. Br J Exp Pathol. 41, 527-535 (1960).
  3. Bhathal, P. S., Christie, G. S. Intravital fluorescence microscopy study of bile ductule proliferation in guinea pigs. Gut. 10 (11), 955 (1969).
  4. Stefenelli, N. Terminal vascular system and microcirculation of the rat liver in intravital microscopy. Wien Klin Wochenschr. 82 (33), 575-578 (1970).
  5. Hori, T., et al. Simple and sure methodology for massive hepatectomy in the mouse. Ann Gastroenterol. 24 (4), 307-318 (2011).
  6. Tanaka, K., et al. Intravital dual-colored visualization of colorectal liver metastasis in living mice using two photon laser scanning microscopy. Microsc Res Tech. 75 (3), 307-315 (2011).
  7. Schemmer, P., Bunzendahl, H., Klar, E., Thurman, R. G. Reperfusion injury is dramatically increased by gentle liver manipulation during harvest. Transpl Int. 13, S525-S527 (2000).
  8. Schemmer, P., et al. Activated Kupffer cells cause a hypermetabolic state after gentle in situ manipulation of liver in rats. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 280 (6), G1076-G1082 (2001).
  9. Toiyama, Y., et al. Intravital imaging of DSS-induced cecal mucosal damage in GFP-transgenic mice using two-photon microscopy. J Gastroenterol. 45 (5), 544-553 (2010).
  10. Zimmon, D. S. The hepatic vasculature and its response to hepatic injury: a working hypothesis. Yale J Biol Med. 50 (5), 497-506 (1977).
  11. Wong, J., et al. A minimal role for selectins in the recruitment of leukocytes into the inflamed liver microvasculature. J Clin Invest. 99 (11), 2782-2790 (1997).
  12. Bonder, C. S., et al. Essential role for neutrophil recruitment to the liver in concanavalin A-induced hepatitis. J Immunol. 172 (1), 45-53 (2004).
  13. Xu, C., Zipfel, W., Shear, J. B., Williams, R. M., Webb, W. W. Multiphoton fluorescence excitation: new spectral windows for biological nonlinear microscopy. Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (20), 10763-10768 (1996).
  14. Centonze, V. E., White, J. G. Multiphoton excitation provides optical sections from deeper within scattering specimens than confocal imaging. Biophys J. 75 (4), 2015-2024 (1998).
  15. Amore, J. D., et al. In vivo multiphoton imaging of a transgenic mouse model of Alzheimer disease reveals marked thioflavine-S-associated alterations in neurite trajectories. J Neuropathol Exp Neurol. 62 (2), 137-145 (2003).
  16. Hickey, M. J., Westhorpe, C. L. V. Imaging inflammatory leukocyte recruitment in kidney, lung and liver–challenges to the multi-step paradigm. Immunol Cell Biol. 91 (4), 281-289 (2013).
  17. McLellan, M. E., Kajdasz, S. T., Hyman, B. T., Bacskai, B. J. In vivo imaging of reactive oxygen species specifically associated with thioflavine S-positive amyloid plaques by multiphoton microscopy. J Neurosci. 23 (6), 2212-2217 (2003).
  18. Geissmann, F., et al. Intravascular Immune Surveillance by CXCR6+ NKT Cells Patrolling Liver Sinusoids. PLoS Biology. 3 (4), (2005).
  19. Velázquez, P., et al. Cutting edge: activation by innate cytokines or microbial antigens can cause arrest of natural killer T cell patrolling of liver sinusoids. J Immunol. 180 (4), 2024-2028 (2008).
  20. Wehr, A., et al. Chemokine receptor CXCR6-dependent hepatic NK T Cell accumulation promotes inflammation and liver fibrosis. J Immunol. 190 (10), 5226-5236 (2013).
  21. Khandoga, A., Hanschen, M., Kessler, J. S., Krombach, F. CD4+ T cells contribute to postischemic liver injury in mice by interacting with sinusoidal endothelium and platelets. Hepatology. 43 (2), 306-315 (2006).
  22. Egen, J. G., et al. Macrophage and T cell dynamics during the development and disintegration of mycobacterial granulomas. Immunity. 28 (2), 271-284 (2008).
  23. Beattie, L., et al. Leishmania donovani-induced expression of signal regulatory protein alpha on Kupffer cells enhances hepatic invariant NKT-cell activation. Eur J Immunol. 40 (1), 117-123 (2010).
  24. Beattie, L., et al. Dynamic imaging of experimental Leishmania donovani-induced hepatic granulomas detects Kupffer cell-restricted antigen presentation to antigen-specific CD8 T cells. PLoS Pathog. 6 (3), e1000805 (2010).
  25. McDonald, B., et al. Intravascular danger signals guide neutrophils to sites of sterile inflammation. Science. 330 (6002), 362-366 (2010).
  26. Vanheule, E., et al. An intravital microscopic study of the hepatic microcirculation in cirrhotic mice models: relationship between fibrosis and angiogenesis. Int J Exp Pathol. 89 (6), 419-432 (2008).
  27. Jenne, C. N., Kubes, P. Immune surveillance by the liver. Nat Immunol. 14 (10), 996-1006 (2013).
  28. Zimmermann, H. W., Tacke, F. Modification of chemokine pathways and immune cell infiltration as a novel therapeutic approach in liver inflammation and fibrosis. Inflamm Allergy Drug Targets. 10 (6), 509-536 (2011).
  29. Kim, J. V., et al. Two-photon laser scanning microscopy imaging of intact spinal cord and cerebral cortex reveals requirement for CXCR6 and neuroinflammation in immune cell infiltration of cortical injury sites. J Immunol Methods. 352 (1-2), 89-100 (2010).
  30. Karlmark, K. R., et al. Hepatic recruitment of the inflammatory Gr1+ monocyte subset upon liver injury promotes hepatic fibrosis. Hepatology. 50 (1), 261-274 (2009).
  31. Heymann, F., et al. Hepatic macrophage migration and differentiation critical for liver fibrosis is mediated by the chemokine receptor C-C motif chemokine receptor 8 in mice. Hepatology. 55 (3), 898-909 (2012).
  32. Ramachandran, P., et al. Differential Ly-6C expression identifies the recruited macrophage phenotype, which orchestrates the regression of murine liver fibrosis. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (46), E3186-E3195 (2012).
  33. Moles, A., et al. A TLR2/S100A9/CXCL-2 signaling network is necessary for neutrophil recruitment in acute and chronic liver injury in the mouse. J Hepatol. 60 (4), 782-791 (2014).
  34. Hammerich, L., et al. Chemokine receptor CCR6-dependent accumulation of γδ T cells in injured liver restricts hepatic inflammation and fibrosis. Hepatology. 59 (2), 630-642 (2014).
  35. Syn, W. -. K., et al. NKT-associated hedgehog and osteopontin drive fibrogenesis in non-alcoholic fatty liver disease. Gut. 61 (9), 1323-1329 (2012).
  36. McDonald, B., et al. Interaction of CD44 and hyaluronan is the dominant mechanism for neutrophil sequestration in inflamed liver sinusoids. J Exp Med. 205 (4), 915-927 (2008).
  37. Egen, J. G., et al. Intravital imaging reveals limited antigen presentation and T cell effector function in mycobacterial granulomas. Immunity. 34 (5), 807-819 (2011).
  38. Singer, G., Stokes, K. Y., Granger, D. N. Hepatic microcirculation in murine sepsis: role of lymphocytes. Pediatr Surg Int. 24 (1), 13-20 (2008).
  39. Phillipson, M., Kubes, P. The neutrophil in vascular inflammation. Nat Med. 17 (11), 1381-1390 (2011).
  40. Khandoga, A. G., et al. In vivo imaging and quantitative analysis of leukocyte directional migration and polarization in inflamed tissue. PLoS One. 4 (3), e4693 (2009).

Play Video

Cite This Article
Heymann, F., Niemietz, P. M., Peusquens, J., Ergen, C., Kohlhepp, M., Mossanen, J. C., Schneider, C., Vogt, M., Tolba, R. H., Trautwein, C., Martin, C., Tacke, F. Long Term Intravital Multiphoton Microscopy Imaging of Immune Cells in Healthy and Diseased Liver Using CXCR6.Gfp Reporter Mice. J. Vis. Exp. (97), e52607, doi:10.3791/52607 (2015).

View Video