Summary

Langzeitintravital Multiphotonen Mikroskopie Imaging von Immunzellen in gesunden und kranken Leber Mit CXCR6.Gfp Reporter Mäuse

Published: March 24, 2015
doi:

Summary

Stable intravital high-resolution imaging of immune cells in the liver is challenging. Here we provide a highly sensitive and reliable method to study migration and cell-cell-interactions of immune cells in mouse liver over long periods (about 6 hours) by intravital multiphoton laser scanning microscopy in combination with intensive care monitoring.

Abstract

Leberentzündung als Reaktion auf eine Verletzung ist ein hochdynamischer Prozess, der die Infiltration von verschiedenen Subtypen von Leukozyten einschließlich Monozyten, Neutrophile, T-Zellen-Untergruppen, B-Zellen, natürliche Killerzellen (NK) und die NKT-Zellen. Intravitalmikroskopie an der Leber zur Überwachung Immunzellmigration ist besonders herausfordernd aufgrund der hohen Anforderungen an die Probenvorbereitung und die Fixierung, die optische Auflösung und die langfristige Überleben des Tieres. Dennoch könnte die Dynamik von entzündlichen Prozessen sowie zellulären Interaktionsstudien kritische Informationen, um die Initiation, Progression und Regression von entzündlichen Lebererkrankungen besser zu verstehen ist. Daher wurde eine hochempfindliche und zuverlässiges Verfahren eingerichtet, um die Migration und Zell-Zell-Wechselwirkungen von verschiedenen Immunzellen in Mausleber über lange Zeiträume (ca. 6 h), die durch intravitale Zwei-Photonen-Laser-Scanning-Mikroskopie (TPLSM) in Kombination mit Intensiv studieren Überwachung.

ent "> enthält die vorgesehenen Verfahren eine schonende Zubereitung und stabile Fixierung der Leber mit minimaler Störung des Organs, langfristig intravital Bildgebung mit Mehrfarben-Multiphotonen-Mikroskopie praktisch ohne Bleichen oder phototoxische Effekte über einen Zeitraum von bis zu 6 Stunden, so dass Tracking- spezifischer Leukozytenuntergruppen und stabile Bilderzeugungsbedingungen durch umfangreiche Überwachung Maus Vitalparameter und Stabilisierung der Zirkulation, Temperatur und Gasaustausch.

Lymphozytenmigration auf Leberentzündung untersuchen CXCR6.gfp Knock-in-Mäusen wurden intravitalen Bildgebung der Leber unter Ausgangsbedingungen und nach akuter und chronischer Leberschädigung durch intraperitoneale Injektion (en) von Kohlenstofftetrachlorid (CCl 4) verursacht wird, ausgesetzt.

CXCR6 ein Chemokin-Rezeptor auf Lymphozyten exprimiert, hauptsächlich auf Natural Killer T (NKT) -, natürliche Killer (NK) – und Untergruppen von T-Lymphozyten, wie CD4-T-Zellen, sondern auch Schleimhaut associATED invariant (MAIT) T-Zellen ein. Im Anschluss an die Migrationsmuster und die Positionierung der CXCR6.gfp + Immunzellen erlaubt einen detaillierten Einblick in ihr verändertes Verhalten auf Leberschäden und damit ihre mögliche Beteiligung im Fortschreiten der Krankheit.

Introduction

Die Visualisierung von Zellen und Zellfunktionen in ganzer Organe oder ganze Organismen von großem Interesse für mehr als 50 Jahren, darunter nahezu alle Teile des Körpers 2. Daher sind einige frühe Studien bereits intravital Bildgebung der Leber 3,4 eingesetzt. Es gibt jedoch einige Einschränkungen auf dem neuesten Stand in Bezug auf langzeitstabil hochauflösende Bildgebung von Lebergewebe.

Aufgrund der anatomischen Position der Leber in engem Kontakt mit der Membran und dem Gastrointestinaltrakt 5, das häufigste Problem für mikroskopische intravitalen Bildgebung Bewegung aufgrund der Atmung und, in geringerem Maße, Peristaltik des Verdauungstraktes 6. Im Vergleich zu anderen soliden Organen, ist die Leberchirurgie eine besondere Herausforderung. Aufgrund der dichten mikrovaskuläre Struktur kann chirurgische Manipulation zu massiven hämorrhagische Läsionen führen, Mikrozirkulationsstörungen 7 und auch die Aktivierung der ansässigen immune Zellen, wie Kupffer-Zelle 8. Daher mechanische Fixierung des Gewebes wie anderswo veröffentlicht 6,9 ist wahrscheinlich mit dem Intravitalmikroskopie Abbildungs ​​stören.

In einer gesunden Leber, 10-15% des Gesamtblutvolumens befindet sich innerhalb der Leber Gefäßsystem und das Organ erhält etwa 25% des Gesamtherzleistung 10, wodurch das Organ sehr anfällig für Veränderungen in der Blutzirkulation (zB Blutdruckschwankungen ). Daher werden Störungen in der Leberdurchblutung aufgrund zB Schubspannung, Vertreibung, Verletzungen, die durch eine übermäßige Gewebebehandlung oder zentrale Zirkulation künstliche Veränderungen der Leukozyten Zugverhalten, eingeschränkter Lebersauerstoffversorgung und damit weitere Leberschäden sowie führen, beeinflussen Leber Immunreaktionen als Organkonservierung und die Gesamtlebenszeit des Tieres.

Frühe mikroskopischen Untersuchungen wurden an Intravital Epifluoreszenz mi basiertMikroskopie, aber einige technische Einschränkungen wie Fotobleichung und geringe Eindringtiefe begrenzen den Einsatz dieser Technik für die langfristige Leber-Bildgebung 4,11,12. Mit der Entwicklung der Multiphotonen-Mikroskopie in den 1990er Jahren wurden die Grenzen der Fotobleichung oder Eindringtiefe im Wesentlichen gelöst, wie diese neue Methode technisch in der Lage, um bildgebende Studien in nahezu allen Organen unter realen Situationen 13-15 durchzuführen war. Jedoch sind die Haupt verbleibenden Herausforderungen bezüglich Bildgebung der Leber waren: Atembewegung, Autofluoreszenz von Lebergewebe, die Sicherung unveränderten Durchblutung der Leber-Sinusoiden und besonders stabile Bildgebung für längere Zeiträume von mehreren Stunden 16.

Obwohl mehrere Studien behandelt die Funktion und die Wanderung von verschiedenen Leukozyten in der Leber 17, zB NKT-Zellen 18-20, T-Zellen 21,22, Leber Makrophagen oder Neutrophile 23,24 25, langfristige Multi microscopy Abbildungs ​​noch nicht erfolgreich hergestellt wurde, die Aufgabe noch schwieriger bei Tieren mit akuten oder chronischen Lebererkrankung aufgrund der vorhandenen Schäden und damit eine höhere Anfälligkeit für weitere Schäden 26. Allerdings, Überwachungs- Zugverhalten und zelluläre Funktion von Leukozyten in der Leber und in Echtzeit ermöglicht neue Einblicke in ihre jeweilige Rolle bei Leber Homöostase und Krankheits 27.

Das Chemokinrezeptor CXCR6 an mehreren Lymphozytensubsets, einschließlich natürlicher Killerzellen (NK), NKT-Zellen und einige T-Zell-Populationen 18,28 ausgedrückt. Frühere Studien an Mäusen haben gezeigt, dass CXCR6 und ihre zugehörigen Liganden CXCL16 kann die Patrouillen der NKT-Zellen auf Lebersinusoide während Homöostase steuern. Folglich ist die Verwendung von CXCR6.gfp Mäusen (Tragen einer Knock-in-der Green Fluorescent Protein [GFP] im CXCR6 Locus) ist beschrieben worden, um die Migration von Lymphozyten in verschiedenen Organen, wie Gehirn 29 zu untersuchenund auch Leber 18,20 und zeigt bei Entzündungen erhöht Infiltration CXCR6.gfp Zellen.

Mit dem in dieser Studie zur Verfügung gestellten Verfahren war es möglich, diese Prozesse über einen langen Zeitraum unter stabilisierten Bedingungen zu folgen. Die Intravitalmultiphotonen-basiertes Verfahren erlaubt Bildgebung, die in hohem Maße reproduzierbar mit minimaler Störung des Tieres und der Orgel; optimiert für die langfristige Überleben der Tiere durch umfangreiche Überwachungs gefolgt von genaue Kontrolle der Atmung und Kreislauf; und hoch flexibel und leicht auch auf andere parenchymatösen Organen wie Niere oder Milz erlassen.

Protocol

HINWEIS: Die Experimente wurden in Übereinstimmung mit den deutschen Rechtsvorschriften über Tierversuche nach dem "Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren" (NIH Veröffentlichung, 8. Auflage, 2011) durchgeführt und der Richtlinie 2010/63 / EU über den Schutz von Tieren für wissenschaftliche Zwecke (Amtsblatt der Europäischen Union, 2010) verwendet. Offizielle Genehmigung wurde von der staatlichen Tierpflege und Verwendung Büro (LANUV Nordrhein-Westfalen, Recklinghausen, Deutschland) ge…

Representative Results

Um unsere Intravital TPLSM Ansatz zu validieren, die wir ausgesetzt CXCR6 gfp / + Mäuse Intravital TPLSM Bildgebung. Die Mäuse wurden entweder unbehandelt als Ausgangskontrollen oder auf eine einzelne intraperitoneale Injektion von Tetrachlorkohlenstoff (CCl 4) unterzogen, um akute Leberschäden 20 zu induzieren. Videosequenzen wurden über einen Zeitraum von 2-5 h auf Grund ihrer grünen Fluoreszenz aufgenommen, und die Zellen wurden über die Zeit verfolg…

Discussion

Das Ziel unserer Studie war es, eine hoch standardisierte, stabile und reproduzierbare Methode zur intravital TPLSM Bildgebung der Leber zu entwickeln. Intravital Imaging im Allgemeinen hat wertvolle Einblicke in das Zellverhalten unter realen Bedingungen folgenden Referenzfahrt und der Interaktion verschiedener Leukozyten-Populationen in der Entwicklung, Homöostase und Krankheit gegeben. Die etwas schwierig anatomischen Position der Leber, durch die Atemwege und peristaltische Darmbewegung direkt an die Leber sowie ih…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

The authors thank the Central Animal facility of the University Hospital Aachen for technical support. This work was supported by the German Research Foundation (DFG Ta434/2-1, DFG SFB/TRR 57) and by the Interdisciplinary Center for Clinical Research (IZKF) Aachen. This work was further supported by the Core Facility ”Two-Photon Imaging”, a Core Facility of the Interdisciplinary Center for Clinical Research (IZKF) Aachen within the Faculty of Medicine at RWTH Aachen University.

Materials

Anesthetics
Buprenorphine Essex Pharma 997.00.00 Analgeticum, 0.1 mg/kg
Fentanyl Rotex Medica charge: 30819
Fluovac anesthesia system Harvard Apparatus 34-1030
Glucose 5% Braun
ISOFLO (Isoflurane Vapor) vaporiser Eickemeyer 4802885
Isoflurane Forene Abbott B 506
Isotonic (0.9%) NaCl solution DeltaSelect GmbH PZN 00765145
Ketamin 10% ceva Charge: 36217/09
Xylazin 2% medistar Charge: 04-03-9338/23
Consumable supplies
20ml Syringe BD Plastipak
250ml Erlenmeyer flask Schott Duran 21 226 36
25mL Beaker 2x Schott Duran 50-1150
2ml syringe BD Plastipak
4-0 Vicryl suture Ethicon V7980
Agarose commercially available
Bepanthen Eye and Nose ointment Bayer Vital GmbH 6029009.00.00
Change-A-Tip Deluxe High-Temp Cautery Kit Fine Science Tools Inc. 18010-00
Cotton Gauze swabs Fuhrmann GmbH 32014
Cover Slip 24x50mm ROTH 1871
Durapore silk tape 3M 1538-1
Feather disposable scalpel Feather 02.001.30.011
Fine Bore Polythene Tubing 0,58mm ID Smiths medical 800/100/200
Histoacryl Braun 1050052 5x 0,5ml
Leukoplast BSN Medical Inc.
Microscope Slides ROTH 1879
Poly-Alcohol Haut…farblos Antisepticum Antiseptica GmbH 72PAH200
Sterican needle 18 G x 1 B. Braun 304622
Sterican needle 27 3/4 G x 1 B. Braun 4657705
Tissue paper commercially available
Surgical Instruments
Amalgam burnisher 3PL Gatz 0110?
Blair retractors (4 pronged (blunt)) x2 Storz&Klein S-01134
Dumont No.7 forceps Fine Science Tools Inc. 91197-00
Graefe forceps curved x1 Fine Science Tools Inc. 11151-10
Graefe forceps straight x2 Fine Science Tools Inc. 11050-10
Heidemann spatula HD2 Stoma 2030.00
Needle holder Mathieu Fine Science Tools Inc. 12010-14
Scissor Fine Science Tools Inc. 14074-11
Semken forceps Fine Science Tools Inc. 11008-13
Small surgical scissors curved Fine Science Tools Inc. 14029-10
Small surgical scissors straight Fine Science Tools Inc. 14028-10
Standard pattern forceps Fine Science Tools Inc. 11000-12
Vannas spring scissors Fine Science Tools Inc. 15000-08
Equipment
ECG Trigger Unit Rapid Biomedical 3000003686
MICROCAPSTAR End-Tidal Carbon Dioxide Analyzer AD Instruments
Minivent Typ 845 Harvard Apparatus 73-0043
Multiphoton microscope Trimscope I LaVision
Perfusor Compact B. Braun
PowerLab 8/30 8 channel recorder AD Instruments PL3508
Temperature controlled heating pad Sygonix 26857617
Temperature sensor comercially available
Temperature controlled System for Microscopes -Cube&Box Life Imaging Services

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Heymann, F., Niemietz, P. M., Peusquens, J., Ergen, C., Kohlhepp, M., Mossanen, J. C., Schneider, C., Vogt, M., Tolba, R. H., Trautwein, C., Martin, C., Tacke, F. Long Term Intravital Multiphoton Microscopy Imaging of Immune Cells in Healthy and Diseased Liver Using CXCR6.Gfp Reporter Mice. J. Vis. Exp. (97), e52607, doi:10.3791/52607 (2015).

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