Summary

לטווח ארוך Intravital multiphoton מיקרוסקופית הדמיה של תאים חיסוני בבריאים וחולה כבד באמצעות עכברים CXCR6.Gfp Reporter

Published: March 24, 2015
doi:

Summary

Stable intravital high-resolution imaging of immune cells in the liver is challenging. Here we provide a highly sensitive and reliable method to study migration and cell-cell-interactions of immune cells in mouse liver over long periods (about 6 hours) by intravital multiphoton laser scanning microscopy in combination with intensive care monitoring.

Abstract

דלקת כבד כתגובה לפציעה היא תהליך דינמי מאוד מעורב החדירה של סוגים נבדלים של לויקוציטים כוללים מונוציטים, נויטרופילים, תת תא T, תאי B, רוצח טבעי (NK) ותאי NKT. מיקרוסקופיה Intravital של הכבד לניטור נדידת תאים חיסוני היא מאתגרת במיוחד בשל הדרישות גבוהות לגבי הכנת מדגם וקיבעון, רזולוציה אופטית והישרדות של בעלי חיים לטווח ארוך. עם זאת, הדינמיקה של תהליכים דלקתיים כמו גם מחקרי אינטראקציה סלולריים יכולה לספק מידע קריטי להבין ייזום, ההתקדמות ונסיגה של מחלת כבד דלקתית טוב יותר. לכן, שיטה רגישה והאמינה ביותר הוקמה כדי ללמוד הגירה ותא-תא-אינטראקציות של תאי חיסון שונים בכבד עכבר על פני תקופות ארוכות (כ -6 שעות) על ידי מיקרוסקופ שני הפוטונים intravital סריקת לייזר (TPLSM) בשילוב עם טיפול נמרץ ניטור.

אף אוזן גרון "> השיטה סיפקה כוללת הכנה עדינה וקיבוע יציב של הכבד עם ההפרעות מינימליות של האיבר; הדמיה intravital ארוכת טווח באמצעות מיקרוסקופ multiphoton ססגוניות עם כמעט ללא photobleaching או תופעות phototoxic על פני תקופה של עד 6 שעות זמן, המאפשרת מעקב של תת ספציפיים לויקוציטים; ותנאי הדמיה יציבים בשל ניטור המקיף של פרמטרים חיוניים עכבר וייצוב של זרימה, טמפרטורה וחילוף גזים.

לחקור הגירת הלימפוציטים על דלקת כבד CXCR6.gfp לדפוק בעכברים היו נתונים להדמית כבד intravital בתנאי מחקר ולאחר פגיעה בכבד אקוטית וכרונית הנגרמת על ידי הזרקת intraperitoneal (ים) של פחמן טטרא (4 CCL).

CXCR6 הוא קולט chemokine הביע בלימפוציטים, בעיקר על הטבעי Killer T (NKT) -, רוצח טבעי (NK) – associ רירית ותת קבוצות של לימפוציטים מסוג T כגון תאי CD4 T, אלא גםשמורת ated תאים (MAIT) T 1. בעקבות הדפוס נודד ומיצוב של CXCR6.gfp + תאי חיסון אפשר תובנה מפורטת להתנהגותם המשתנית שלהם על פגיעה בכבד, ולכן מעורבות הפוטנציאל שלהם בהתקדמות מחלה.

Introduction

ההדמיה של תאים ותפקודים תאיים בכל איברים או אפילו כל יצורים הייתה עניין רב במשך יותר מ -50 שנים, הכוללת כמעט את כל חלקי הגוף 2. לכן, חלק מהמחקרים המוקדמים כבר בהדמית intravital של הכבד 3,4. עם זאת, יש מספר מגבלות קיימות מעודכנים לגבי הדמיה ברזולוציה גבוהה יציבה לטווח הארוך של רקמת כבד.

בשל המיקום האנטומי של הכבד בקשר הדוק עם הסרעפת ומערכת עיכול 5, הבעיה הנפוצה ביותר להדמיה מיקרוסקופית intravital היא תנועה בשל נשימה ו, ובמידה פחותה, נפיחה של המעי 6. בהשוואה לאיברים מוצקים אחרים, ניתוח בכבד הוא מאתגר במיוחד. בשל מבנה כלי הדם הצפוף, מניפולציה כירורגית יכולה להוביל לנגעים מדממים מסיביים, זרימת דם לקוי 7 וגם הפעלה של תושב iתאי mmune כגון תאי Kupffer 8. לכן, קיבעון מכאני של הרקמה כפי שפורסם במקום אחר 6,9 עלול להפריע להדמיה מיקרוסקופית intravital.

בכבד בריא, 10-15% מכלל נפח הדם שוכנים בתוך כלי הדם בכבד, והאיבר מקבל כ -25% מתפוקת הלב הכוללת של 10, טיוח האיבר רגיש מאוד לשינויים במחזור הדם (למשל, תנודות בלחץ הדם ). לכן, שיבושים בזרימת דם בכבד עקב למשל, מאמץ גזירה, עקירה, פגיעה על ידי טיפול ברקמה מוגזם או מחזור מרכזי יובילו לשינויים מלאכותיים בהתנהגות נדידה לויקוציטים, חמצון כבד פגום ונזק כבד ולכן עוד יותר, המשפיעים על תגובה חיסונית בכבד, כמו גם כשימור איברים וזמן חיים כולל של בעלי החיים.

מחקרים מיקרוסקופיים מוקדמים התבססו על מיל epifluorescence intravitalcroscopy, אבל כמה אילוצים טכניים כגון הלבנת תמונה ועומק חדירה נמוכה להגביל את השימוש בטכניקה זו להדמיה כבד לטווח ארוך 4,11,12. עם התפתחותה של מיקרוסקופיה multiphoton בשנת 1990, את המגבלות של הלבנת תמונה או עומק חדירה נפתרו בעיקר, כשיטת חדשה זו הייתה מבחינה טכנית מסוגלת לבצע בדיקות הדמיה כמעט בכל האיברים תחת מצבים בחיים אמיתיים 13-15. עם זאת, האתגרים העיקריים שנותרו פתוחים בנוגע להדמית כבד היו: תנועות נשימה, autofluorescence של רקמת כבד, הבטחת זרימת דם ללא שינוי בsinusoids הכבד, והדמיה יציבה במיוחד לתקופות ארוכות יותר של מספר שעות 16.

למרות שמספר מחקרים התייחסו לפונקציה וההגירה של לויקוציטים השונים בכבד 17, למשל, NKT-תאים 18-20, תאי T 21,22, מקרופאגים כבד 23,24 או נויטרופילים 25, מ 'multiphoton לטווח ארוךההדמיה icroscopy עדיין לא נוצרה בהצלחה, משימה מאתגרת יותר אפילו בבעלי חיים עם מחלת כבד אקוטית או כרונית עקב הנזק הקיים ורגישות גבוהה יותר ולכן לפגיעה נוספת 26. עם זאת, ניטור התנהגות נדידה ותפקוד תאי של לויקוציטים בכבד בזמן אמת מאפשר תובנות רומן בתפקיד המסוים שלהם בהומאוסטזיס כבד ומחלות 27.

CXCR6 קולט chemokine באה לידי ביטוי בכמה תת-רכיבי הלימפוציטים, כוללים רוצח טבעי (NK) תאים, תאי NKT וכמה אוכלוסיות תאי T 18,28. מחקרים קודמים בעכברים הראו כי CXCR6 וCXCL16 יגנד המקור שלה יכולים לשלוט הסיורים של תאי NKT על sinusoids הכבד במהלך הומאוסטזיס. כתוצאה מכך, השימוש בעכברי CXCR6.gfp (ביצוע נוק-בחלבון פלואורסצנטי ירוק [GFP] של במוקד CXCR6) תוארו לחקור את ההגירה של לימפוציטים באיברים שונים כגון מוח 29וגם כבד 18,20, מראה עליית חדירה של תאי CXCR6.gfp על דלקת.

בשיטה שנקבעה במחקר זה ניתן היה לעקוב אחר תהליכים אלה על פני תקופה ארוכה של זמן בתנאים התייצבו. הליך multiphoton intravital מבוסס אפשר הדמיה שהייתה מאוד לשחזור עם ההפרעות מינימליות של בעלי החיים והאיברים; מותאם להישרדות של בעלי חיים לטווח ארוך על ידי ניטור נרחב אחריו שליטה הדוקה של נשימה ומחזור דם; וגמישים וקלים מאוד לאמץ גם לאיברי parenchymal אחרים כגון כליות או טחול.

Protocol

הערה: הניסויים בוצעו בהתאם לחקיקה המסדירה הגרמנית מחקרים בבעלי החיים הבאים "המדריך לטיפול ושימוש בחי מעבדה" (NIH פרסום, מהדורת 8, 2011) וההוראה 2010/63 / האיחוד האירופי על ההגנה על בעלי החיים משמש למטרות מדעיות (כתב עת הרשמית של האיחוד האירופי, 2010). אישור רשמי ניתנה ממשרד ?…

Representative Results

כדי לאמת את גישת TPLSM intravital שלנו, אנו חשופים GFP / + עכברי CXCR6 להדמית TPLSM intravital. עכברים שלא טופלו או הושארו כפקדים בסיסיים או נתון להזרקת intraperitoneal אחת של פחמן טטרא (CCL 4) כדי לגרום לנזק בכבד חריף 20. רצפי וידאו נלקחו על פני …

Discussion

מטרת המחקר שלנו הייתה לפתח שיטה סטנדרטית מאוד, יציבה ושחזור ההדמיה TPLSM intravital של הכבד. ההדמיה Intravital בכלל נתנה תובנות רבות ערך להתנהגות סלולרית בתנאי חיים אמיתיים הבאים ביות ואינטראקציה של אוכלוסיות לויקוציטים שונות בפיתוח, הומאוסטזיס ומחלה. עם זאת, העמדה המאתגרת מעט ?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

The authors thank the Central Animal facility of the University Hospital Aachen for technical support. This work was supported by the German Research Foundation (DFG Ta434/2-1, DFG SFB/TRR 57) and by the Interdisciplinary Center for Clinical Research (IZKF) Aachen. This work was further supported by the Core Facility ”Two-Photon Imaging”, a Core Facility of the Interdisciplinary Center for Clinical Research (IZKF) Aachen within the Faculty of Medicine at RWTH Aachen University.

Materials

Anesthetics
Buprenorphine Essex Pharma 997.00.00 Analgeticum, 0.1 mg/kg
Fentanyl Rotex Medica charge: 30819
Fluovac anesthesia system Harvard Apparatus 34-1030
Glucose 5% Braun
ISOFLO (Isoflurane Vapor) vaporiser Eickemeyer 4802885
Isoflurane Forene Abbott B 506
Isotonic (0.9%) NaCl solution DeltaSelect GmbH PZN 00765145
Ketamin 10% ceva Charge: 36217/09
Xylazin 2% medistar Charge: 04-03-9338/23
Consumable supplies
20ml Syringe BD Plastipak
250ml Erlenmeyer flask Schott Duran 21 226 36
25mL Beaker 2x Schott Duran 50-1150
2ml syringe BD Plastipak
4-0 Vicryl suture Ethicon V7980
Agarose commercially available
Bepanthen Eye and Nose ointment Bayer Vital GmbH 6029009.00.00
Change-A-Tip Deluxe High-Temp Cautery Kit Fine Science Tools Inc. 18010-00
Cotton Gauze swabs Fuhrmann GmbH 32014
Cover Slip 24x50mm ROTH 1871
Durapore silk tape 3M 1538-1
Feather disposable scalpel Feather 02.001.30.011
Fine Bore Polythene Tubing 0,58mm ID Smiths medical 800/100/200
Histoacryl Braun 1050052 5x 0,5ml
Leukoplast BSN Medical Inc.
Microscope Slides ROTH 1879
Poly-Alcohol Haut…farblos Antisepticum Antiseptica GmbH 72PAH200
Sterican needle 18 G x 1 B. Braun 304622
Sterican needle 27 3/4 G x 1 B. Braun 4657705
Tissue paper commercially available
Surgical Instruments
Amalgam burnisher 3PL Gatz 0110?
Blair retractors (4 pronged (blunt)) x2 Storz&Klein S-01134
Dumont No.7 forceps Fine Science Tools Inc. 91197-00
Graefe forceps curved x1 Fine Science Tools Inc. 11151-10
Graefe forceps straight x2 Fine Science Tools Inc. 11050-10
Heidemann spatula HD2 Stoma 2030.00
Needle holder Mathieu Fine Science Tools Inc. 12010-14
Scissor Fine Science Tools Inc. 14074-11
Semken forceps Fine Science Tools Inc. 11008-13
Small surgical scissors curved Fine Science Tools Inc. 14029-10
Small surgical scissors straight Fine Science Tools Inc. 14028-10
Standard pattern forceps Fine Science Tools Inc. 11000-12
Vannas spring scissors Fine Science Tools Inc. 15000-08
Equipment
ECG Trigger Unit Rapid Biomedical 3000003686
MICROCAPSTAR End-Tidal Carbon Dioxide Analyzer AD Instruments
Minivent Typ 845 Harvard Apparatus 73-0043
Multiphoton microscope Trimscope I LaVision
Perfusor Compact B. Braun
PowerLab 8/30 8 channel recorder AD Instruments PL3508
Temperature controlled heating pad Sygonix 26857617
Temperature sensor comercially available
Temperature controlled System for Microscopes -Cube&Box Life Imaging Services

References

  1. Dusseaux, M., et al. Human MAIT cells are xenobiotic-resistant, tissue-targeted, CD161hi IL-17-secreting T cells. Blood. 117 (4), 1250-1259 (2011).
  2. Reese, A. J. The effect of hypoxia on liver secretion studied by intravital fluorescence microscopy. Br J Exp Pathol. 41, 527-535 (1960).
  3. Bhathal, P. S., Christie, G. S. Intravital fluorescence microscopy study of bile ductule proliferation in guinea pigs. Gut. 10 (11), 955 (1969).
  4. Stefenelli, N. Terminal vascular system and microcirculation of the rat liver in intravital microscopy. Wien Klin Wochenschr. 82 (33), 575-578 (1970).
  5. Hori, T., et al. Simple and sure methodology for massive hepatectomy in the mouse. Ann Gastroenterol. 24 (4), 307-318 (2011).
  6. Tanaka, K., et al. Intravital dual-colored visualization of colorectal liver metastasis in living mice using two photon laser scanning microscopy. Microsc Res Tech. 75 (3), 307-315 (2011).
  7. Schemmer, P., Bunzendahl, H., Klar, E., Thurman, R. G. Reperfusion injury is dramatically increased by gentle liver manipulation during harvest. Transpl Int. 13, S525-S527 (2000).
  8. Schemmer, P., et al. Activated Kupffer cells cause a hypermetabolic state after gentle in situ manipulation of liver in rats. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 280 (6), G1076-G1082 (2001).
  9. Toiyama, Y., et al. Intravital imaging of DSS-induced cecal mucosal damage in GFP-transgenic mice using two-photon microscopy. J Gastroenterol. 45 (5), 544-553 (2010).
  10. Zimmon, D. S. The hepatic vasculature and its response to hepatic injury: a working hypothesis. Yale J Biol Med. 50 (5), 497-506 (1977).
  11. Wong, J., et al. A minimal role for selectins in the recruitment of leukocytes into the inflamed liver microvasculature. J Clin Invest. 99 (11), 2782-2790 (1997).
  12. Bonder, C. S., et al. Essential role for neutrophil recruitment to the liver in concanavalin A-induced hepatitis. J Immunol. 172 (1), 45-53 (2004).
  13. Xu, C., Zipfel, W., Shear, J. B., Williams, R. M., Webb, W. W. Multiphoton fluorescence excitation: new spectral windows for biological nonlinear microscopy. Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (20), 10763-10768 (1996).
  14. Centonze, V. E., White, J. G. Multiphoton excitation provides optical sections from deeper within scattering specimens than confocal imaging. Biophys J. 75 (4), 2015-2024 (1998).
  15. Amore, J. D., et al. In vivo multiphoton imaging of a transgenic mouse model of Alzheimer disease reveals marked thioflavine-S-associated alterations in neurite trajectories. J Neuropathol Exp Neurol. 62 (2), 137-145 (2003).
  16. Hickey, M. J., Westhorpe, C. L. V. Imaging inflammatory leukocyte recruitment in kidney, lung and liver–challenges to the multi-step paradigm. Immunol Cell Biol. 91 (4), 281-289 (2013).
  17. McLellan, M. E., Kajdasz, S. T., Hyman, B. T., Bacskai, B. J. In vivo imaging of reactive oxygen species specifically associated with thioflavine S-positive amyloid plaques by multiphoton microscopy. J Neurosci. 23 (6), 2212-2217 (2003).
  18. Geissmann, F., et al. Intravascular Immune Surveillance by CXCR6+ NKT Cells Patrolling Liver Sinusoids. PLoS Biology. 3 (4), (2005).
  19. Velázquez, P., et al. Cutting edge: activation by innate cytokines or microbial antigens can cause arrest of natural killer T cell patrolling of liver sinusoids. J Immunol. 180 (4), 2024-2028 (2008).
  20. Wehr, A., et al. Chemokine receptor CXCR6-dependent hepatic NK T Cell accumulation promotes inflammation and liver fibrosis. J Immunol. 190 (10), 5226-5236 (2013).
  21. Khandoga, A., Hanschen, M., Kessler, J. S., Krombach, F. CD4+ T cells contribute to postischemic liver injury in mice by interacting with sinusoidal endothelium and platelets. Hepatology. 43 (2), 306-315 (2006).
  22. Egen, J. G., et al. Macrophage and T cell dynamics during the development and disintegration of mycobacterial granulomas. Immunity. 28 (2), 271-284 (2008).
  23. Beattie, L., et al. Leishmania donovani-induced expression of signal regulatory protein alpha on Kupffer cells enhances hepatic invariant NKT-cell activation. Eur J Immunol. 40 (1), 117-123 (2010).
  24. Beattie, L., et al. Dynamic imaging of experimental Leishmania donovani-induced hepatic granulomas detects Kupffer cell-restricted antigen presentation to antigen-specific CD8 T cells. PLoS Pathog. 6 (3), e1000805 (2010).
  25. McDonald, B., et al. Intravascular danger signals guide neutrophils to sites of sterile inflammation. Science. 330 (6002), 362-366 (2010).
  26. Vanheule, E., et al. An intravital microscopic study of the hepatic microcirculation in cirrhotic mice models: relationship between fibrosis and angiogenesis. Int J Exp Pathol. 89 (6), 419-432 (2008).
  27. Jenne, C. N., Kubes, P. Immune surveillance by the liver. Nat Immunol. 14 (10), 996-1006 (2013).
  28. Zimmermann, H. W., Tacke, F. Modification of chemokine pathways and immune cell infiltration as a novel therapeutic approach in liver inflammation and fibrosis. Inflamm Allergy Drug Targets. 10 (6), 509-536 (2011).
  29. Kim, J. V., et al. Two-photon laser scanning microscopy imaging of intact spinal cord and cerebral cortex reveals requirement for CXCR6 and neuroinflammation in immune cell infiltration of cortical injury sites. J Immunol Methods. 352 (1-2), 89-100 (2010).
  30. Karlmark, K. R., et al. Hepatic recruitment of the inflammatory Gr1+ monocyte subset upon liver injury promotes hepatic fibrosis. Hepatology. 50 (1), 261-274 (2009).
  31. Heymann, F., et al. Hepatic macrophage migration and differentiation critical for liver fibrosis is mediated by the chemokine receptor C-C motif chemokine receptor 8 in mice. Hepatology. 55 (3), 898-909 (2012).
  32. Ramachandran, P., et al. Differential Ly-6C expression identifies the recruited macrophage phenotype, which orchestrates the regression of murine liver fibrosis. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (46), E3186-E3195 (2012).
  33. Moles, A., et al. A TLR2/S100A9/CXCL-2 signaling network is necessary for neutrophil recruitment in acute and chronic liver injury in the mouse. J Hepatol. 60 (4), 782-791 (2014).
  34. Hammerich, L., et al. Chemokine receptor CCR6-dependent accumulation of γδ T cells in injured liver restricts hepatic inflammation and fibrosis. Hepatology. 59 (2), 630-642 (2014).
  35. Syn, W. -. K., et al. NKT-associated hedgehog and osteopontin drive fibrogenesis in non-alcoholic fatty liver disease. Gut. 61 (9), 1323-1329 (2012).
  36. McDonald, B., et al. Interaction of CD44 and hyaluronan is the dominant mechanism for neutrophil sequestration in inflamed liver sinusoids. J Exp Med. 205 (4), 915-927 (2008).
  37. Egen, J. G., et al. Intravital imaging reveals limited antigen presentation and T cell effector function in mycobacterial granulomas. Immunity. 34 (5), 807-819 (2011).
  38. Singer, G., Stokes, K. Y., Granger, D. N. Hepatic microcirculation in murine sepsis: role of lymphocytes. Pediatr Surg Int. 24 (1), 13-20 (2008).
  39. Phillipson, M., Kubes, P. The neutrophil in vascular inflammation. Nat Med. 17 (11), 1381-1390 (2011).
  40. Khandoga, A. G., et al. In vivo imaging and quantitative analysis of leukocyte directional migration and polarization in inflamed tissue. PLoS One. 4 (3), e4693 (2009).

Play Video

Cite This Article
Heymann, F., Niemietz, P. M., Peusquens, J., Ergen, C., Kohlhepp, M., Mossanen, J. C., Schneider, C., Vogt, M., Tolba, R. H., Trautwein, C., Martin, C., Tacke, F. Long Term Intravital Multiphoton Microscopy Imaging of Immune Cells in Healthy and Diseased Liver Using CXCR6.Gfp Reporter Mice. J. Vis. Exp. (97), e52607, doi:10.3791/52607 (2015).

View Video