微小管の相互作用のサイクルに結合されたATPターンオーバーのサイクル:キネシンは微小管を有するヌクレオチド依存性相互作用によって特徴付けられる。ここでは、蛍光標識されたヌクレオチドおよびストップフロー蛍光を用いキネシンのATPターンオーバーサイクルにおける個別のヌクレオチド遷移の動態を分析するためのプロトコルを記述している。
微小管関連モータータンパク質キネシンスーパーファミリーは、両方のは、ATPを加水分解し、微小管を結合し、特徴的なモータードメインを共有しています。キネシンは、ATP売上高のと微小管の相互作用の両方のスーパーファミリー間での違いを表示します。これらの違いは、そのような貨物輸送、微小管滑り、微小管脱重合と微小管の安定化などのさまざまな機能に対して特定のキネシンを調整。キネシンの作用機序を理解するためには、ATP代謝回転の化学サイクルが微小管の相互作用の機械的なサイクルに連結されているかを理解することが重要です。 ATPターンオーバーサイクルを分析するために、1つのアプローチは、サイクル内の個別のステップを可視化する蛍光標識ヌクレオチドを利用することである。 ATPターンオーバーサイクルにおける各ヌクレオチドの移行の動力学を決定することは、完全なサイクルの律速段階またはステップを識別することができる。キネシンのためには、律速段階を知ることが重要であるキネシンは、微小管と相互作用する場合、微小管が存在しないことは、このステップは、一般的に数千倍に加速されるように。微小管の非存在下でのサイクルは完全にキネシンのATPターンオーバーサイクルを理解するために、微小管の存在下でのそれと比較する。個別のヌクレオチド転移の動力学は、一般的に手動で、特に微小管の存在下で、反応物質を混合することによって観察するにはあまりにも高速である。そのような速度は数ミリ秒ほど少しの時間スケールで観察することを可能にするストップフロー蛍光光度計など、急速な混合装置は、そのような遷移を監視するために使用することができる。ここでは、ストップトフローによる試薬の迅速な混合は、キネシンのATPターンオーバー周期を分析するために蛍光標識ヌクレオチドと組み合わせて使用されるプロトコルを説明する。
キネシンは、高度に保存されたモータードメイン1によって特徴付けられるタンパク質のスーパーファミリーである。キネシンモータードメインは、ヌクレオチド依存的に微小管と相互作用する。キネシンファミリーのメンバーは、微小管の動態2,3を制御する非転位微小管の端結合キネシンと微小管に沿っ向かう形で貨物を運ぶトランスロケーションキネシン、、、から関数の範囲を表示します。
キネシンは微小管細胞骨格4-6との相互作用を調節するためにアデノシン-5'-三リン酸(ATP)の売上高を使用しています。 ATP、ADP、ADP.Piあるいは全くヌクレオチドが結合することができます( 図1):微小管のためのキネシンモータードメインため、その親和性のコンホメーションは、その塩基の状態に依存します。キネシンの分子メカニズムを理解するために、ATPの代謝回転と微小管の相互作用との関係の理解が必要である。ザ·reforeは、キネシンの分野における主要な目標は、微小管の存在下および非存在下で異なるヌクレオチド状態と、それらの両方の間の遷移の動態の機能的特性を特徴付けることである。
キネシンのための最も簡単なATPターンオーバーサイクル1図は、4つの可能な状態で構成されています。ヌクレオチドフリー(Φ)、ATP結合、ADP.P iは結合型とADP結合 4遷移のそれぞれは、前進することを特徴とすると。逆方向速度定数(k xおよびkはそれぞれ-x)。
ATP代謝回転の化学サイクルが微小管の相互作用の機械的なサイクルに連結されているかを理解するためには、microtubが存在しない場合に速度制限され、ATPターンオーバーサイクルのどの段階を決定する必要がありますその後ulesとサイクルは、微小管の存在によって変化する方法を決定します。最も単純なATPターンオーバーサイクルは4つの個別の化学物質のステップで構成されています(1)ATPが空の部位に結合する(Φは空のサイト、 すなわち、ヌクレオチドのないキネシンを表す); (2)ATP開裂; (3)リン酸解離、(4)ADP解離( 図1)。律速段階は完了し、ATPターンオーバーサイクルの速度定数を設定します。そのため、個別の遷移の各測定され、完全なサイクルの速度定数と比較する必要があり律速となるステップを決定する。全体的なATPターンオーバーサイクル速度定数を測定する方法がここに記載されていないが、ここでは参考7に見ることができる、個々の化学工程のための速度定数を決定することができる方法を記載している。塩基加水分解タンパク質のターンオーバーのサイクルで個別の遷移を研究するために利用可能な方法がいくつかあります。ここで紹介する方法はadvantagを取るフルオロフォアmethylanthraniloylで標識されたヌクレオチドの性質のeは、通常、タンパク質8に結合すると蛍光強度の変化を表示するマントと呼ばれる。その小さなサイズは、リボース( 図2A)に結合されたとき、それは一般にヌクレオチド結合または加水9-12の動態にほとんど又は全く影響を及ぼさない、ことを意味するためマントグループが使用されている。ここでは、キネシンのATPターンオーバーサイクルでヌクレオチド結合および解離の観察を可能にするストップフロー蛍光と併せてマント標識ヌクレオチドの使用を記述するプロトコルを提示する。
ここでは、キネシンのヌクレオチド状態間の遷移の動態の観察と分析のためのプロトコルを提示する。これらのプロトコルは、蛍光標識ヌクレオチドと組み合わせて迅速な混合方法ストップフローを利用している。このタイプの方法は、結合およびキネシン9-11,13-16のさまざまな解離ヌクレオチドを研究するために広く使用されてきた。記載されている方法は、リン酸の放出を観察します( 図1、ステップ3)許可されていません。しかし、ストップフロー蛍光は蛍光強度の変化17に結合するために、リン酸の産生をリンセンシングタンパク質を使用することによって、この移行を観察するために使用することができる。タンパク質に結合した場合、一般的に蛍光強度の増加を呈する小フルオロフォアmethylanthraniloyl(マント)で標識された使用ヌクレオチドを、提示される方法。 R上の2 'または3'位のいずれかにコンジュゲートまた、マントのフルオロフォア、ibose、多くの場合、ヌクレオチド9-12の結合、解離または加水分解にほとんどまたは全く影響を及ぼさない。マント標識ヌクレオチドは、商業的供給源(材料のリストを参照されたい)から容易に入手可能であり、単一異性体8まで精製の 際には迅速に再平衡として2 '、3'結合体の混合物として提供される。マント標識ヌクレオチドは、ヌクレオチド結合および解離の動態を観察することが可能な優れたレポーター分子を作る。
蛍光標識ヌクレオチドの使用が記載されたアッセイのうち読み取りが蛍光強度の実時間変化であることを意味している。これは、試薬の迅速な混合及びその後の反応に伴う蛍光の変化をリアルタイムで観察できるストップフロー蛍光に対するこれらのアッセイに最適です。検出の方法として、混合技術と蛍光としてストップトフローの組み合わせが比較的サンプルエフあるシステムを作り出すficient。たとえば、 図3Cに示すデータを取得することは、0.8が必要- 、精製されたキネシン13の1.0 mgのMCAK、及び図4Bに示すデータを取得するために、精製〜キネシン13 0.3mgの、MCAKを必要とする。フルオロフォアとしてマントの使用の1つの欠点は、それが光退色する傾向があることである。これは、ストップフローにおいて、キネシンの非存在下で、反応緩衝液でマント標識ヌクレオチドの溶液を混合することによってキネシン反応速度から分離して観察することができる。マント基は漂白なるにつれて蛍光強度の遅い減少が観察される。マントグループの光退色を記載されたプロトコルで使用されるタイムスケールの範囲にわたってよく線形関数によって記述される。したがって、光退色のためのデータを修正する簡単な方法は、線形関数( すなわち 、メートル+ c)のではなく、単一のパラメータによって記述より一般的な平らなベースラインにより記述ベースラインと指数関数にフィットすることである。
<p clお尻= "jove_content"> mantATPバインディングmantATPの会合および解離速度定数微小管の非存在下におけるキネシンヌクレオチド結合部位に結合したままで(第2節)、ADPを測定する場合、削除する必要があります。これはmantATPの会合および解離( 図1、ステップ1)は、ADPの解離か ら分離して観察することができます。これを達成するためにキネシンは、ヌクレオチド結合部位(ステップ2.1)上のEDTAの少なくとも50倍過剰とインキュベートする。 EDTAはMgが2 +、ヌクレオチド11の放出をもたらすヌクレオチド結合ポケットから解離させるのMg 2 +イオンを封鎖する。実施することは、2.1のステップしたがって、 – 2.3、それが2 +のMgを含まない緩衝液を使用することが重要です。ヌクレオチドフリーキネシンタンパク質は、遊離ヌクレオチドからおよびEDTAの両方からそれを分離するために交換されるバッファである。この分離、使い捨ての重力流れGEを達成するためにlの濾過カラム(材料のリストを参照)に十分なものであり、シンプルで使い迅速である。ヌクレオチド無料キネシンとmantATPの相互作用は、結合および解離速度定数(ステップ2.8)のデコンボリューションを可能にするためにmantATP濃度(ステップ2.4)の範囲で行われる。このタイプの実験の背後にある理論は、1つのウェルがmantATPの最低濃度で始まるこれらの実験を行う際の基準18に記載されている。これは、異なる濃度の間の洗浄ステップの必要性を削除します。これは、おそらくmantATP濃度が増加するにつれて、ストップフロー蛍光光度計の感度を調整する必要がある。 mantATP濃度は常に疑似一次条件下を維持するためにキネシンヌクレオチド結合部位の濃度よりも少なくとも5倍過剰に存在する必要があります。 mantATPの濃度が増加するにつれてしかし、信号の変化が減少キネシンに結合するヌクレオチドの割合として圧倒さになり得る。 Therefo再、キネシンの濃度もmantATPの濃度は、ヌクレオチド結合部位(ステップ2.6)上の10倍モル過剰よりも大きくなることはありませんようにmantATPのそれぞれの新しい濃度で増加している。
mantADP解離
mantADPための会合および解離速度定数はmantATP(セクション2)について記載した同じ方法によって決定することができるが。キネシンからのADPの解離を直接mantADP(ステップ3.1〜3.3)を有するヌクレオチド結合部位をプリロードすることによって観察することができるmantADP.kinesin複合体は、非標識ATP(ステップ3.5)を超えると混合される。過剰の非標識ATPはキネシンにmantADPの再結合を防止し、それによって解離反応( 図1、K 4)mantADPの関連付けから分離して観察することができます。このアッセイにおいて、非標識ATPの濃度は、NUCの少なくとも50倍モル過剰でなければならない結合部位をleotide。このアッセイの背後にある理論は十分にこの直接法は、ステップ2.8に記載されたy軸に外挿より一定の解離速度のため、より正確な値を与える基準18に記載されている。
微小管を含める
記載された方法はまた、微小管の存在下でヌクレオチド結合及び解離の動態を決定するために用いることができる。 図3Bと4Bの下、注射器:微小管は、先行ストップフローでの混合に注射器を含むヌクレオチドに導入される ( 挿入図 )。この構成では、キネシンは微小管を満たすと同時にヌクレオチドを満たす。安定化された微小管は、チューブリン重合体の寿命は、安定化化学物質、のいずれかの使用によって拡張される場合、使用されているような 'グアノシン-5などのタキソール、または非加水分解性GTP類似体、など – [(α、β) -methyleno]三リン酸(GMPCPPは、材料のリストを参照してください)。これは、液体窒素9,19で何ヶ月も保存することができる微小管を作るためにGMPCPPでチューブリン重合の2つのサイクルを使用することが可能である。あらかじめ準備された微小管の使用は、これらのアッセイを実行する際に実際的な困難を軽減します。アッセイにおける微小管を含めるためには、微小管の安定性に適した反応緩衝液を使用することが重要である。選択のバッファーは80 mMのPIPES pHを6.9、1 mMのMgCl 2および1mMのEGTA(BRB80として知られている)20,21を含む最も一般的に使用されるバッファーでベースPIPES、です。
記載の方法は、キネシンの使用に限定されないが、任意のヌクレオチド結合タンパク質に適合し、適用することができる。例えば、同様の方法は、分子モーター12,22のミオシンファミリーのメンバーのATPターンオーバーサイクルに適用されており、マント標識グアノシンヌクレオチドの使用は、さらに拡張しこのタイプの方法は、タンパク質23,24を加水GTPする。
The authors have nothing to disclose.
この作品は、バイオテクノロジー·生物科学研究会議(BBSRC)、王立協会とノッティンガム大学でサポートされています。
Name of Material/Equipment | Company | Catalogue Number | Comments/Description |
2’/3’-(N-methylanthraniloyl) adenosine-5’triphosphate | Jena Biosciences | # NU-202 | mantATP |
2’/3’-(N-methylanthraniloyl) adenosine-5’-diphosphate | Jena Biosciences | # NU-201 | mantADP |
Mg-ATP | Roche | # 10519979001 | The disodium salt of ATP is made to a concentration of 100 mM in 100 mM MgCl2. Concentration should be verified by absorption at 260 nm (e = 15400 M-1cm-1). Solution stored in aliquots at -20 oC. |
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Fisher Scientific | BP120-500 | 0.5 M stock solution in water, pH 8.0. HAZARD: powder harmful if inhaled. |
Dithiothreitol (DTT) | Melford | MB1015 | 1 M stock solution in water made fresh for use on the same day. HAZARD: powder harmful if inhaled or in contact with the skin. |
NAP-5 column | GE Healthcare | # 17-0853 | G-25 sephadex resin gravity-flow gel filtration column |
GMPCPP | Jena Biosciences | # NU-405 | nonhydrolysable analogue of GTP |
Stopped-flow fluorimeter | Applied Photophysics | SX20 | A fluorimeter with some plumbing attached, which allows reagents to be rapidly mixed in the observation cuvette. Thereby allowing the kinetics of reactions on timescales of ~0.1 - 100 s to be monitored. |