Kinesine von Nukleotid-abhängige Wechselwirkung mit Mikrotubuli aus: ein Zyklus von ATP Umsatz zu einem Zyklus von Mikrotubuli-Wechselwirkung gekoppelt. Hier beschreiben wir Protokolle, die Kinetik der einzelnen Nukleotid-Übergänge in der ATP-Umsatz Zyklus eines Kinesin mit fluoreszenzmarkierten Nukleotiden und Stopped-Flow-Fluoreszenz analysiert.
Die Kinesin-Superfamilie der Mikrotubuli-assoziierten Motorproteine teilen einen charakteristischen Motordomäne, die sowohl hydrolysiert ATP und bindet Mikrotubuli. Kinesinen anzuzeigen Unterschiede innerhalb der Superfamilie sowohl in Umsatz und ATP in Mikrotubuli-Interaktion. Diese Unterschiede anpassen spezifischen Kinesinen, um verschiedene Funktionen wie Luftfrachtbeförderung, Mikrotubuli-Gleiten, Mikrotubuli-Depolymerisation und Stabilisierung von Mikrotubuli. Um den Mechanismus der Wirkung eines Kinesin verstehen, ist es wichtig zu verstehen, wie der chemischen Zyklus der ATP Umsatz der mechanischen Zyklus der Mikrotubuli-Wechselwirkung gekoppelt. Um den ATP Umsatz-Zyklus zu sezieren, ist ein Ansatz, um fluoreszenzmarkierte Nukleotide zu nutzen, um einzelne Schritte des Zyklus zu visualisieren. Bestimmung der Kinetik der Übergang jedes Nukleotid in der ATP-Umsatz Zyklus ermöglicht die geschwindigkeitsbestimmende Schritt oder Schritte zur vollständigen Zyklus zu identifizieren. Für Kinesin, ist es wichtig, den geschwindigkeitsbegrenzenden Schritt zu kennen,die Abwesenheit von Mikrotubuli, da dieser Schritt im allgemeinen beschleunigt mehrere Tausendfache, wenn das Kinesin Wechselwirkung mit Mikrotubuli. Der Zyklus in Abwesenheit von Mikrotubuli wird dann zu der in Gegenwart von Mikrotubuli zu einer Kinesin ATP Umsatz Zyklus verstehen verglichen. Die Kinetik der einzelnen Nucleotid-Übergänge sind in der Regel zu hoch, um durch manuelles Mischen von Reaktanten, insbesondere in Anwesenheit von Mikrotubuli zu beobachten. Eine schnelle Mischvorrichtung, wie einer Stopped-Flow-Fluorimeter, die Kinetik auf Zeitskalen von nur wenigen Millisekunden beobachtet werden kann, kann verwendet werden, um solche Übergänge zu beobachten. Hier beschreiben wir Protokolle, in denen eine schnelle Vermischung der Reagenzien durch stopped-flow in Verbindung mit Fluoreszenz-markierten Nukleotiden verwendet werden, um die ATP-Umsatz Zyklus eines Kinesin sezieren.
Die Kinesin-Superfamilie sind für Proteine, die durch eine stark konservierte Motordomäne 1. Die Kinesin Motordomäne in Wechselwirkung mit Mikrotubuli in einer Nukleotid-abhängige Weise. Mitglieder der Kinesin-Familie zeigen eine Reihe von Funktionen aus translozierenden Kinesinen, die Fracht in einem gerichteten Art und Weise entlang von Mikrotubuli zu tragen, nicht-Translokation Mikrotubuli-bindenden Ende Kinesinen, die die Dynamik der Mikrotubuli 2,3 regulieren.
Kinesinen verwenden Sie den Umsatz von adensosine-5'-Triphosphat (ATP), um ihre Interaktion mit dem Mikrotubuli-Zytoskelett 4-6 regulieren. Die Konformation des Kinesin-Motordomäne und somit seine Affinität für Mikrotubuli hängt von ihrer Nukleotid Zustand: ATP, ADP kann, ADP.Pi oder keine Nucleotid gebunden werden (Abbildung 1). Den molekularen Mechanismus eines Kinesin verstehen, ist ein Verständnis der Beziehung zwischen der ATP-Umsatz und die Mikrotubuli-Wechselwirkung erforderlich sind. DieDaher liegt ein Hauptziel in der Kinesin-Feld, um die funktionellen Eigenschaften der verschiedenen Nukleotid Zustände und die Kinetik der Übergänge zwischen diesen beiden in der Gegenwart und Abwesenheit von Mikrotubuli zu charakterisieren.
Abbildung 1. Die einfachste ATP Umsatz Zyklus für eine Kinesin besteht aus vier möglichen Zuständen: Nukleotid-freie (Φ), ATP-gebundenen ADP.P i -gebundenen und ADP-gebundenen Jeder der vier Übergänge von einem vorderen und charakterisiert. Rückwärtsgeschwindigkeitskonstante (k x und k x beziehungsweise).
Um zu verstehen, wie sich die chemische Zyklus der ATP Umsatz der mechanischen Kreislauf der Mikrotubuli-Interaktion gekoppelt, muss man die Stufe in der ATP-Umsatz Zyklus zu bestimmen, ist Ratenbegrenzung in der Abwesenheit von microtubModule und dann bestimmen, wie der Zyklus wird durch die Anwesenheit von Mikrotubuli verändert. Die einfachste ATP Umsatz-Zyklus besteht aus vier einzelnen Chemikalien Schritten: (1) ATP-Bindung an die leere Stelle (Φ bezeichnet das leere Seite, dh, Nukleotid-freien Kinesin); (2) ATP-Spaltung; (3) phosphat Dissoziation und (4) ADP-Dissoziation (Abbildung 1). Der geschwindigkeitsbestimmende Schritt setzt die Geschwindigkeitskonstante für die komplette ATP Umsatz-Zyklus. Deshalb, um zu bestimmen, welche geschwindigkeitsbestimmende Schritt jedes der einzelnen Übergänge müssen gemessen und verglichen, um die Geschwindigkeitskonstante für den gesamten Zyklus ist. Methoden, um die Gesamt ATP Umsatz Taktrate konstant werden hier nicht beschrieben zu messen, kann aber in Bezug 7. hier gefunden werden, beschreiben wir Methoden, mit denen Geschwindigkeitskonstanten für einzelne chemische Schritte bestimmt werden kann. Es gibt eine Reihe von Verfahren zur Verfügung, um individuelle Übergänge in dem Umschlagszyklus eines Nukleotids hydrolysierende Protein zu untersuchen. Die hier vorgestellten Methoden nehmen Advantage der Eigenschaften der Nucleotide mit dem Fluorophor markierten methylanthraniloyl, die üblicherweise als mant, die eine Änderung in der Fluoreszenzintensität nach der Bindung an Protein 8 Anzeige bezeichnet. Mant der Gruppe verwendet wird, da seine geringe Größe bedeutet, dass, wenn sie auf die Ribose (2A) gekoppelt ist, hat es im allgemeinen wenig oder keine Wirkung auf die Kinetik der Nukleotid-Bindungs oder Hydrolyse 9-12. Hier stellen wir Protokolle beschreiben die Verwendung von mant-markierten Nukleotiden in Verbindung mit der Stopped-Flow-Fluoreszenz, um die Beobachtung der Bindung und Dissoziation Nukleotidsequenz der ATP-Umsatz Zyklus eines Kinesin ermöglichen.
Hier stellen wir Protokolle zur Beobachtung und Analyse der Kinetik der Übergänge zwischen den Zuständen für eine Nukleotid-Kinesin. Diese Protokolle nutzen die schnelle Vermischung Stopped-Flow-Methode in Verbindung mit fluoreszenzmarkierten Nukleotiden. Verfahren dieser Art haben ausgiebig genutzt worden Nukleotid-Bindungs und Dissoziation für eine Vielzahl von Kinesinen 9-11,13-16 zu studieren. Die beschriebenen Beobachtung der Phosphatfreisetzung (Abbildung 1, Schritt 3) nicht erlauben Methoden. Jedoch kann Stopped-Flow-Fluoreszenz verwendet wird, um diesen Übergang unter Verwendung eines Phosphat Sensorprotein zu koppeln, die Produktion von Phosphat zu einem Fluoreszenzintensitätsänderung 17 zu beobachten. Die Methoden vorgestellt Verwendung Nukleotide mit kleinen Fluorophor methylanthraniloyl (mant) gekennzeichnet, die in der Regel zeigen eine Zunahme der Fluoreszenzintensität, wenn an Proteine gebunden. Weiterhin mant Fluorophor konjugiert, wenn entweder die 2 'oder 3'-Position an der Ribose, hat oft eine geringe oder keine Wirkung auf die Bindung, Dissoziation oder Hydrolyse des Nukleotids 9-12. Mant-markierte Nukleotide sind leicht aus kommerziellen Quellen erhältlich (siehe Liste der Materialien) und Mischungen der 2 'und 3'-Konjugat, wie sie schnell wieder ins Gleichgewicht, wenn auf ein einziges Isomer 8 gereinigt ist. Mant-markierte Nukleotide sind ausgezeichnete Reportermolekülen, durch die die Kinetiken der Nukleotid-Bindung und Dissoziation beobachtet werden.
Die Verwendung von fluoreszenzmarkierten Nukleotiden bedeutet, dass das Auslesen der beschriebenen Tests ist eine Echtzeit-Veränderung der Fluoreszenzintensität. Dies macht diese ideal für Assays Stopped-Flow-Fluoreszenz, die schnelle Vermischung der Reagenzien und Echtzeit-Beobachtung von Veränderungen in der Fluoreszenz mit der anschließenden Reaktion verbunden werden können. Die Kombination der Stopped-Flow als Mischtechnik und Fluoreszenz als Verfahren zur Detektion erzeugt ein System, das relativ Probe efreichend. Um beispielsweise die in Figur 3C gezeigten Daten erwerben erfordert 0,8 bis 1,0 mg gereinigtes Kinesin-13, MCAK, und die in 4B gezeigten Daten erwerben erfordert ~ 0,3 mg gereinigtes Kinesin-13, MCAK. Ein Nachteil der Verwendung von mant als Fluorophor ist, dass sie anfällig für Photobleichung ist. Dies kann getrennt von Kinesin Reaktionskinetik durch Mischen einer Lösung von mant-markierte Nukleotid mit Reaktionspuffer, in Abwesenheit von Kinesin in der Stopped-Flow zu beobachten. Eine langsame Abnahme der Fluoreszenzintensität beobachtet, wie die mant-Gruppe wird gebleicht. Über den Bereich der Zeitskalen in den beschriebenen Photobleaching der mant-Gruppe Protokolle verwendet wird, auch durch eine lineare Funktion beschrieben. Daher ist ein einfacher Weg, um Daten für Photobleaching zu korrigieren, um zu einer exponentiellen Funktion mit einer durch eine lineare Funktion (dh mt + c) eher als die gemeinsame Grundlinie flach, durch einen einzigen Parameter beschrieben beschriebenen Grundlinie passen.
<p class = "jove_content"> mantATP verbindlichBei der Messung von Geschwindigkeitskonstanten für Assoziation und Dissoziation mantATP (Abschnitt 2) die ADP, die mit der Kinesin-Nukleotid-Bindungsstelle in der Abwesenheit von Mikrotubuli verbunden bleibt, müssen entfernt werden. Dies ermöglicht mantATP Assoziation und Dissoziation (Abbildung 1, Schritt 1) isoliert von ADP Dissoziation beobachtet werden. Um dies zu erreichen Kinesin mit mindestens einer 50-fachen Überschuß an EDTA mehr Nukleotid-Bindungsstellen (Schritt 2.1) inkubiert. Die EDTA-Mg 2 +-Ionen maskiert verursacht Mg 2 + aus der Nukleotid-Bindungstasche, die bei der Freisetzung von dem Nukleotid 11 Ergebnisse distanzieren. Deshalb, wenn die Durchführung Schritte 2,1-2,3, ist es wichtig, einen Puffer frei von Mg 2 + zu verwenden. Das Nukleotid-kostenlos-Kinesin-Protein-Puffer ausgetauscht, um sich sowohl aus freien Nukleotid und von EDTA zu trennen. Um diese Trennung, eine Wegwerfgravitationsströmungs ge volll Filtrationssäule ist ausreichend und ist einfach und schnell zu bedienen (siehe Liste der Materialien). Das Zusammenspiel von mantATP mit Nukleotid kostenlos Kinesin wird bei einer Reihe von mantATP Konzentrationen (Schritt 2.4) durchgeführt, um Entfaltung der Assoziation und Dissoziation Geschwindigkeitskonstanten (Schritt 2.8) zu ermöglichen. Die Theorie hinter Experimente dieser Art ist auch in Bezug 18 beschrieben Bei der Durchführung dieser Experimente mit der niedrigsten Konzentration von mantATP beginnt. Dies beseitigt die Notwendigkeit für die Waschschritte zwischen verschiedenen Konzentrationen. Wird es wahrscheinlich notwendig sein, die Empfindlichkeit der Stopped-Flow-Fluorimeter einzustellen als die mantATP Konzentration erhöht wird. Die mantATP Konzentration muss immer mindestens 5-fachen Überschuß über die Konzentration der Kinesin-Nukleotid-Bindungsstellen auf Pseudo Bedingungen erster Ordnung aufrecht zu erhalten. Da jedoch die Konzentration von mantATP erhöht wird, die Signaländerung kann als Anteil der Nucleotidsequenz, die abnimmt Kinesin bindet überschwemmt zu werden. Therefore wird die Konzentration des Kinesin auch für jedes neue Konzentration mantATP erhöht, so dass die Konzentration des mantATP ist niemals mehr als 10-fachen molaren Überschuß über Nukleotid-Bindungsstellen (Schritt 2.6).
mantADP Dissoziation
Obwohl Assoziation und Dissoziation Geschwindigkeitskonstanten für mantADP kann durch das gleiche für mantATP (Abschnitt 2) beschriebenen Verfahren bestimmt werden. Dissoziation von ADP aus einem Kinesin kann direkt durch Vorspannen der Nukleotid-Bindungsstelle mit mantADP (Schritte 3.1-3.3) Die mantADP.kinesin Komplex wird dann mit einem Überschuss von unmarkiertem ATP (Schritt 3.5) gemischt beobachtet werden. Der Überschuss unmarkierten ATP verhindert erneute Bindung von mantADP auf die Kinesin und ermöglicht die Spaltungsreaktion (Abbildung 1, K 4) isoliert von Verband der mantADP beobachtet werden, wodurch. In diesem Assay wird die Konzentration von unmarkiertem ATP mindestens einem 50-fachen molaren Überschuß von Nuk seinleotide Bindungsstellen. Die Theorie hinter diesem Test ist gut in Bezug 18 beschrieben Diese direkte Methode gibt einen genaueren Wert für die Dissoziationsgeschwindigkeitskonstante als die Hochrechnung auf das in Schritt 2.8 beschrieben y-Achse.
Einbeziehung der Mikrotubuli
Die beschriebenen Verfahren können auch verwendet werden, um die Kinetik der Nukleotid-Bindungs und Dissoziation in Gegenwart von Mikrotubuli zu bestimmen. Mikrotubuli sind an das Nukleotid enthaltenden Spritze vor dem Mischen in der Stopped-Flow eingeführt: die untere Spritze in 3B und 4B (Einlagen). In dieser Konfiguration wird die Kinesin die Nukleotidsequenz gleichzeitig erfüllen, da sie die Mikrotubuli erfüllt. Mikrotubuli stabilisiert werden verwendet, wo die Lebensdauer des Tubulin-Polymer durch die Verwendung entweder einer chemischen Stabilisierung, verlängert, wie Taxol oder einem nicht hydrolysierbaren GTP-Analogon, wie Guanosin-5 '- [(α, β) -methyleno] Triphosphat (GMPCPP, siehe Liste der Materialien). Es ist möglich, zwei Zyklen der Tubulin-Polymerisation mit GMPCPP verwenden, um Mikrotubuli, für viele Monate in flüssigem Stickstoff gelagert werden 9,19 tätigen. Die Verwendung von vorgefertigten Mikrotubuli reduziert deutlich die praktischen Schwierigkeiten bei der Durchführung dieser Tests. Mikrotubuli in den Assays schließen, ist es wichtig, einen Reaktionspuffer für die Mikrotubuli Stabilität zu verwenden. Der Puffer der Wahl ist PIPES basiert, mit dem am häufigsten verwendeten Puffer, der 80 mM PIPES pH 6,9, 1 mM MgCl 2 und 1 mM EGTA (als BRB80 bekannt) 20,21.
Die beschriebenen Verfahren sind nicht darauf beschränkt, mit Kinesin, sondern kann angepasst und einem Nukleotid-Bindungsprotein verwendet werden. Zum Beispiel wurden ähnliche Verfahren wie die ATP Umsatz Zyklus von Mitgliedern der Familie von Myosin molekularen Motoren 12,22 und die Verwendung von markierten mant Guanosinnukleotiden erstreckt sich weiter angewendetVerfahren dieser Art GTP hydrolysierende Proteine 23,24.
The authors have nothing to disclose.
Diese Arbeit wird von der Biotechnologie und Biologische Wissenschaften Research Council (BBSRC), der Royal Society und der Universität von Nottingham unterstützt.
Name of Material/Equipment | Company | Catalogue Number | Comments/Description |
2’/3’-(N-methylanthraniloyl) adenosine-5’triphosphate | Jena Biosciences | # NU-202 | mantATP |
2’/3’-(N-methylanthraniloyl) adenosine-5’-diphosphate | Jena Biosciences | # NU-201 | mantADP |
Mg-ATP | Roche | # 10519979001 | The disodium salt of ATP is made to a concentration of 100 mM in 100 mM MgCl2. Concentration should be verified by absorption at 260 nm (e = 15400 M-1cm-1). Solution stored in aliquots at -20 oC. |
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Fisher Scientific | BP120-500 | 0.5 M stock solution in water, pH 8.0. HAZARD: powder harmful if inhaled. |
Dithiothreitol (DTT) | Melford | MB1015 | 1 M stock solution in water made fresh for use on the same day. HAZARD: powder harmful if inhaled or in contact with the skin. |
NAP-5 column | GE Healthcare | # 17-0853 | G-25 sephadex resin gravity-flow gel filtration column |
GMPCPP | Jena Biosciences | # NU-405 | nonhydrolysable analogue of GTP |
Stopped-flow fluorimeter | Applied Photophysics | SX20 | A fluorimeter with some plumbing attached, which allows reagents to be rapidly mixed in the observation cuvette. Thereby allowing the kinetics of reactions on timescales of ~0.1 - 100 s to be monitored. |