وتتميز Kinesins بواسطة التفاعل تعتمد على النوكليوتيدات مع ميكروتثبول: دورة من دوران ATP بالإضافة إلى دورة التفاعل أنيبيب. هنا، نحن تصف بروتوكولات لتحليل حركية التحولات النوكليوتيدات الفردية في دورة دوران اعبي التنس المحترفين من كينيسين باستخدام النيوكليوتيدات fluorescently المسمى ومضان توقف تدفق.
الفصيلة كينيسين من البروتينات المرتبطة أنيبيب محرك تشترك مجال السيارات المميزة التي تتحلمأ كل من ATP ويربط الأنابيب الدقيقة. عرض Kinesins الخلافات عبر الفصيلة سواء في دوران ATP والتفاعل أنيبيب. هذه الاختلافات خياط kinesins محددة لمختلف المهام مثل نقل البضائع، أنيبيب انزلاق، أنيبيب التحلل والاستقرار أنيبيب. لفهم آلية عمل لكينيسين من المهم أن نفهم كيف يقترن دورة الكيميائية ATP دوران لدورة ميكانيكية التفاعل أنيبيب. لتشريح دورة دوران اعبي التنس المحترفين، نهج واحد هو استخدام النيوكليوتيدات fluorescently المسمى لتصور الخطوات الفردية في الدورة. تحديد حركية كل انتقال النوكليوتيدات في دورة دوران ATP يسمح الحد من معدل خطوة أو خطوات لدورة كاملة لتحديدها. لكينيسين، فمن المهم أن نعرف الخطوة معدل الحد، فيغياب الأنابيب الدقيقة، وهذه الخطوة تتسارع بشكل عام عدة آلاف أضعاف عندما يتفاعل مع كينيسين الأنابيب الدقيقة. دورة في غياب الأنابيب الدقيقة ثم يتم مقارنة ذلك بحضور الأنابيب الدقيقة لنفهم تماما ATP دورة دوران لكينيسين ل. حركية التحولات النوكليوتيدات الفردية عادة ما تكون سريعة جدا لمراقبة عن طريق خلط المواد المتفاعلة يدويا، وخصوصا في وجود الأنابيب الدقيقة. جهاز الخلط السريع، مثل مقياس التألق توقف تدفق، والذي يسمح حركية التي يتعين مراعاتها في فترات زمنية أقل قدر من أجزاء قليلة من الثانية، ويمكن استخدامها لرصد هذه التحولات. هنا، نحن تصف البروتوكولات التي تستخدم في خلط السريع من الكواشف التي توقف تدفق بالتزامن مع النيوكليوتيدات fluorescently المسمى لتشريح دورة دوران اعبي التنس المحترفين من كينيسين.
وkinesins هي الفصيلة من البروتينات التي تتميز مجال السيارات حفظا للغاية 1. يتفاعل المجال كينيسين المحرك مع ميكروتثبول بطريقة تعتمد على النوكليوتيدات. أعضاء الأسرة كينيسين عرض مجموعة من الوظائف من translocating kinesins التي تحمل البضائع بطريقة موجهة على طول الأنابيب الدقيقة، لkinesins ملزم نهاية غير translocating أنيبيب، التي تنظم ديناميات أنيبيب 2،3.
Kinesins استخدام دوران adensosine-5'-ثلاثي الفوسفات (ATP) لتنظيم تفاعلها مع أنيبيب الهيكل الخلوي 4-6. التشكل المجال كينيسين المحرك وبالتالي لها تقارب للأنيبيب يعتمد على الدولة النوكليوتيدات لها: ATP، ADP، ADP.Pi أو النوكليوتيدات لا يمكن ربط (الشكل 1). لفهم الآلية الجزيئية لكينيسين، مطلوب فهم العلاقة بين دوران ATP والتفاعل أنيبيب. وrefore، هدفا رئيسيا في مجال كينيسين هو لوصف الخصائص الفنية للدول النوكليوتيدات مختلفة وحركية التحولات بين لهم على حد سواء في وجود وغياب الأنابيب الدقيقة.
يتكون الشكل 1. أبسط دورة دوران اعبي التنس المحترفين لكينيسين من أربع ولايات المحتملة: (Φ) خالية من النوكليوتيدات، ATP محددة، ADP.P ط -bound ومتجهة الى ADP ويتميز كل من التحولات الأربعة إلى الأمام و. متخلف ثابت معدل (ك س و ك -x على التوالي).
لفهم كيفية يقترن دورة الكيميائي للدوران ATP لدورة ميكانيكية التفاعل أنيبيب، لا بد من تحديد أي خطوة في دورة دوران ATP هو معدل الحد في غياب microtubules ومن ثم تحديد كيفية تغيير دورة من خلال وجود الأنابيب الدقيقة. وتتكون أبسط دورة دوران اعبي التنس المحترفين من أربع خطوات فردية المواد الكيميائية: (1) ATP ملزم لموقع فارغ (Φ يدل الموقع فارغة، أي خالية من النوكليوتيدات كينيسين). (2) الانقسام ATP. (3) التفكك الفوسفات و (4) التفكك ADP (الشكل 1). في خطوة تحد من معدل تحدد معدل ثابت للدوران دورة كاملة للاعبي التنس المحترفين. لذلك، لتحديد الخطوة هو الحد من معدل كل من التحولات الفردية يجب قياس ومقارنة مع معدل ثابت لدورة كاملة. أساليب لقياس لا توصف هنا ثابت معدل دوران ATP دورة العام لكن يمكن العثور عليها في إشارة 7. هنا، نحن تصف الأساليب التي يمكن من خلالها تحديد الثوابت معدل للخطوات الكيميائية الفردية. هناك عدد من الطرق المتاحة لدراسة التحولات الفردية في دورة دوران البروتين النوكليوتيدات hydrolyzing. الأساليب المقدمة هنا تأخذ الميزه(ه) من خصائص النيوكليوتيدات المسمى مع methylanthraniloyl fluorophore، يشار اليها عادة باسم MANT، التي تعرض تغير في كثافة مضان عليها ملزمة لبروتين 8. يتم استخدام مجموعة MANT لأن حجمه صغير يعني، عندما يقترن إلى الريبوز (الشكل 2A)، ولها عموما تأثير ضئيل أو لا على حركية النوكليوتيدات ملزمة أو التحلل 9-12. هنا، نقدم بروتوكولات واصفا استخدام النيوكليوتيدات المسمى MANT، بالتزامن مع مضان توقف تدفق، للسماح مراقبة النوكليوتيدات ملزمة والتفكك في دورة دوران اعبي التنس المحترفين من كينيسين.
هنا، نقدم بروتوكولات للمراقبة وتحليل حركية التحولات بين الدول النوكليوتيدات لكينيسين. هذه البروتوكولات السريع الاستفادة من طريقة خلط توقف تدفق بالتزامن مع النيوكليوتيدات fluorescently المسمى. وقد استخدمت أساليب من هذا النوع على نطاق واسع لدراسة النوكليوتيدات ملزمة والتفكك لمجموعة متنوعة من kinesins 9-11،13-16. الأساليب المذكورة لا تسمح الملاحظة الإفراج الفوسفات (الشكل 1، الخطوة 3). ومع ذلك، مضان توقف تدفق يمكن استخدامها لمراقبة هذا التحول باستخدام الاستشعار عن البروتين الفوسفات لزوجين إنتاج الفوسفات إلى كثافة مضان التغيير 17. أساليب عرض النيوكليوتيدات استخدام المسمى مع methylanthraniloyl fluorophore صغيرة (MANT)، والتي تظهر عادة زيادة في كثافة مضان عندما بد أن البروتين. علاوة على ذلك، fluorophore MANT، عندما مترافق إما موقف 2 "أو 3" على صibose، وغالبا ما له تأثير ضئيل أو لا على ملزم، التفكك أو التحلل من النوكليوتيدات 9-12. هي النيوكليوتيدات MANT المسمى متاحة بسهولة من المصادر التجارية (انظر قائمة المواد) ويتم توفيرها في شكل خلائط من 2 "و 3" المترافقة لأنها بسرعة إعادة تتوازن عند تخصيبه لايزومير واحد 8. النيوكليوتيدات المسمى MANT تجعل جزيئات مراسل الممتازة التي يمكن ملاحظتها حركية النوكليوتيدات ملزمة والتفكك.
استخدام النيوكليوتيدات fluorescently المسمى يعني أن قراءة من المقايسات وصفها هو تغيير في الوقت الحقيقي في كثافة مضان. وهذا يجعل هذه المقايسات مثالية لمضان توقف تدفق، والذي يسمح خلط السريع الكواشف ومراقبة الوقت الحقيقي من التغيرات في مضان المرتبطة رد فعل لاحق. مزيج من توقف تدفق وتقنية خلط ومضان كأسلوب للكشف ينتج النظام الذي هو EF عينة نسبيا كافية من. على سبيل المثال، للحصول على البيانات هو مبين في الشكل 3C يتطلب 0،8-1،0 ملغ من تنقية كينيسين-13، MCAK، والحصول على البيانات هو مبين في الشكل 4B يتطلب ~ 0.3 ملغ من تنقية كينيسين-13، MCAK. عيب واحد من استخدام MANT باعتباره fluorophore هو أنه عرضة للphotobleaching من. هذا يمكن ملاحظتها في العزلة من كينيسين حركية التفاعل عن طريق خلط محلول المسمى MANT النوكليوتيدات مع العازلة رد الفعل، في غياب كينيسين، في التدفق توقف. لوحظ انخفاض بطيء في كثافة مضان كما تصبح مجموعة MANT ابيض. على مجموعة من الجداول الزمنية المستخدمة في البروتوكولات المذكورة photobleaching من المجموعة MANT يوصف جيدا بواسطة دالة خطية. لذلك، طريقة بسيطة لتصحيح البيانات ل photobleaching هي لتناسب إلى الدالة الأسية مع خط الأساس وصفها دالة خطية (أي طن متري + ج) بدلا من خط الأساس مسطح أكثر شيوعا، التي وصفها معلمة واحدة.
<p clالحمار = "jove_content"> mantATP ملزمةعند قياس الثوابت معدل تكوين الجمعيات والتفكك من mantATP (القسم 2) ADP، والذي لا يزال يرتبط مع موقع النوكليوتيدات ملزم كينيسين في غياب الأنابيب الدقيقة، ويجب إزالتها. وهذا يسمح جمعية mantATP والتفكك (الشكل 1، الخطوة 1) التي يتعين مراعاتها في معزل عن التفكك ADP. لتحقيق وحضنت هذا كينيسين مع ما لا يقل عن 50 أضعاف الفائض من EDTA على مواقع الربط النوكليوتيدات (الخطوة 2.1). وEDTA تعزل المغنيسيوم 2+ تسبب أيونات المغنيسيوم 2+ إلى فصل من جيب ملزمة النوكليوتيدات، مما يؤدي الى الافراج عن 11 النوكليوتيدات. ولذلك، عند تنفيذ الخطوات 2،1-2،3، من المهم جدا لاستخدام منطقة عازلة خالية من المغنيسيوم 2+. البروتين كينيسين خالية من النوكليوتيدات هو تبادل عازلة لفصلها كلا من النوكليوتيدات الحرة ومن EDTA. لتحقيق هذا الفصل، وهو المتاح خطورة تدفق جنرال الكتريكالعمود لتر الترشيح كافية وبسيط وسريع لاستخدام (انظر قائمة المواد). ويتم تفاعل مع mantATP النوكليوتيدات كينيسين مجانا من خلال مجموعة من تركيزات mantATP (الخطوة 2.4) لتمكين deconvolution الثوابت الجمعيات والتفكك معدل (الخطوة 2.8). النظرية وراء تجارب من هذا النوع يوصف أيضا في إشارة 18. في تنفيذ هذه التجارب واحد يبدأ مع أدنى تركيز mantATP. هذا يزيل ضرورة اتخاذ خطوات غسل بين تركيزات مختلفة. فمن المرجح أن يكون ضروريا لضبط حساسية مقياس التألق توقف تدفق وتركيز mantATP يزداد. يجب أن يكون تركيز mantATP دائما ما يزيد على الأقل 5 أضعاف خلال تركيز المواقع ملزمة كينيسين النوكليوتيدات للحفاظ على الأوضاع الزائفة من الدرجة الأولى. لكن، وكما تركيز mantATP يزداد، فإن التغيير يمكن أن تصبح إشارة اغراق باعتبارها جزء من النوكليوتيدات التي تربط لكينيسين الانخفاضات. Therefoإعادة، ويزداد أيضا تركيز كينيسين لكل تركيز جديد من mantATP مثل أن تركيز mantATP أبدا أكبر من المولي يزيد 10 أضعاف على مواقع الربط النوكليوتيدات (الخطوة 2.6).
mantADP التفكك
على الرغم من أن الجمعيات ومعدل التفكك الثوابت لmantADP يمكن تحديده من خلال نفس الأسلوب وصفها لmantATP (القسم 2). تفكك ADP من كينيسين يمكن ملاحظة مباشرة من قبل تحميلها مسبقا في الموقع، النوكليوتيدات ملزمة مع mantADP (خطوات 3،1-3،3) ثم يتم خلط مجمع mantADP.kinesin مع وجود فائض من توضيحها ATP (الخطوة 3.5). والخالي من الملصقات ATP الزائد يمنع إعادة الربط من mantADP إلى كينيسين ويسمح رد الفعل التفكك (الشكل 1، ك 4) لوحظ في معزل عن رابطة mantADP بذلك. في هذا الاختبار يجب أن يكون تركيز ATP الخالي من الملصقات على الأقل فائض المولي 50 أضعاف من مجلس التوحيد الوطنىleotide مواقع الربط. النظرية وراء هذا الاختبار يوصف جيدا في إشارة 18. هذه الطريقة المباشرة يعطي قيمة أكثر دقة لمعدل التفكك المستمر من استقراء إلى المحور ص هو موضح في الخطوة 2.8.
إدراج ميكروتثبول
ويمكن أيضا أن تستخدم الأساليب المذكورة لتحديد حركية النوكليوتيدات ملزمة والتفكك في وجود الأنابيب الدقيقة. يتم إدخال الأنابيب الدقيقة لالنوكليوتيدات تحتوي على حقنة قبل الاختلاط في التدفق توقف: انخفاض حقنة في الشكل 3B و 4B (إدراجات). في هذا التكوين، فإن كينيسين تلبية النوكليوتيدات في نفس الوقت لأنها تلبي الأنابيب الدقيقة. وتستخدم الأنابيب الدقيقة استقرت، حيث تم تمديد عمر البوليمر تويولين عن طريق استخدام إما الكيميائية الاستقرار، مثل التاكسول، أو GTP التناظرية nonhydrolysable، مثل غوانوزين-5 '- [(α، β) -methyleno] ثلاثي الفوسفات (GMPCPP، انظر قائمة المواد). فمن الممكن استخدام دورتين من تويولين البلمرة مع GMPCPP لجعل الأنابيب الدقيقة التي يمكن تخزينها لعدة أشهر في 9،19 النيتروجين السائل. استخدام الأنابيب الدقيقة المعدة مسبقا يخفف كثيرا من الصعوبات العملية في أداء هذه المقايسات. لتشمل الأنابيب الدقيقة في المقايسات، فمن المهم استخدام منطقة عازلة رد فعل مناسب للاستقرار أنيبيب. المخزن المؤقت الاختيار هو أساس أنابيب، مع المخزن المؤقت الأكثر شيوعا تحتوي على 80 ملي أنابيب درجة الحموضة 6.9، 1 ملم MgCl 2 و 1 ملي EGTA (المعروف باسم BRB80) 20،21.
الأساليب المذكورة لا تقتصر على استخدامها مع kinesins، ولكن يمكن تكييفها وتطبيقها على أي بروتين ملزمة النوكليوتيدات. على سبيل المثال، تم تطبيق أساليب مشابهة لدورة دوران ATP من أعضاء الأسرة الميوسين المحركات الجزيئية 12،22 واستخدام MANT المسمى النيوكليوتيدات غوانوزين تمتد أبعدأساليب من هذا النوع إلى GTP hydrolyzing البروتينات 23،24.
The authors have nothing to disclose.
ويدعم هذا العمل من قبل التكنولوجيا الحيوية والعلوم البيولوجية مجلس البحوث (BBSRC)، والجمعية الملكية وجامعة نوتنجهام.
Name of Material/Equipment | Company | Catalogue Number | Comments/Description |
2’/3’-(N-methylanthraniloyl) adenosine-5’triphosphate | Jena Biosciences | # NU-202 | mantATP |
2’/3’-(N-methylanthraniloyl) adenosine-5’-diphosphate | Jena Biosciences | # NU-201 | mantADP |
Mg-ATP | Roche | # 10519979001 | The disodium salt of ATP is made to a concentration of 100 mM in 100 mM MgCl2. Concentration should be verified by absorption at 260 nm (e = 15400 M-1cm-1). Solution stored in aliquots at -20 oC. |
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Fisher Scientific | BP120-500 | 0.5 M stock solution in water, pH 8.0. HAZARD: powder harmful if inhaled. |
Dithiothreitol (DTT) | Melford | MB1015 | 1 M stock solution in water made fresh for use on the same day. HAZARD: powder harmful if inhaled or in contact with the skin. |
NAP-5 column | GE Healthcare | # 17-0853 | G-25 sephadex resin gravity-flow gel filtration column |
GMPCPP | Jena Biosciences | # NU-405 | nonhydrolysable analogue of GTP |
Stopped-flow fluorimeter | Applied Photophysics | SX20 | A fluorimeter with some plumbing attached, which allows reagents to be rapidly mixed in the observation cuvette. Thereby allowing the kinetics of reactions on timescales of ~0.1 - 100 s to be monitored. |