Summary

Fare Beyin Çeşitli Bölgelerinde Telomeraz Aktivite: Radyoaktif olmayan Telomeraz Amplifikasyon Protokolü tekrarlayın (TRAP) Deneyi

Published: September 02, 2014
doi:

Summary

Telomerase is expressed in the neonatal brain and also in distinct regions of the adult brain. We present a non-toxic time saving TRAP assay for the analysis of telomerase activity in various regions of the mouse brain and detection of differences in telomerase activity between male and female mouse brains.

Abstract

Telomeraz, bir ribonükleoprotein, telomer uzunluğu muhafaza ve dolayısıyla genomik bütünlüğü, çoğalmasını ve ömrünü teşvik sorumludur. Nöronlar gibi mitotik olmayan, son derece aktif hücreler için hayatta kalan olası önemini göstermektedir, ilave olarak, telomeraz gibi oksidatif stresten mitokondri korur ve apoptoza direnç kazandırmaktadır. Daha önce çeşitli fare beyin bölgelerinde telomeraz aktivitesi ve ekspresyonunu artırmak ve oksidatif stres motor nöronlar hücreleri korumak için yeni telomeraz aktivatörlerinin yeteneğini gösterdi. Bu sonuçlar telomeraz çeşitli lezyonlar gelen nöronların korunması dahil olduğu görüşünü güçlendirmektedir. Beyinde telomeraz rolünü vurgulamak amacıyla, burada erkek ve dişi fare beyninde telomeraz aktivitesini ve yaş olan bağımlılığını karşılaştırın. TRAP yönteminin çeşitli dokular veya hücre hatlarında telomeraz aktivitesini tespit etmek için standart bir yöntemdir. Burada analı göstermekCHAPS kullanılarak protein çıkarımı ile denatüre edici olmayan fare beyninin üç bölgede telomeraz aktivitesi sis, standart TRAP modifikasyonu ile, ardından tampon lisis.

Bu 2-aşamalı bir deneyde, endojen telomeraz TTAGGG 6 bp'lik bir tekrar (telomeraz reaksiyonu) ekleyerek belirli bir alt-tabaka, telomeraz (TH primer) ilerlemektedir. Telomeraz reaksiyonu ürünleri 6 bp'lik fazlalıklarının bir DNA merdiveni oluşturarak bir PCR tepkimesi ile yükseltilir. DNA merdiveni analizi son derece hassas bir nükleik asit boyası ile boyandı, ardından% 4.5 yüksek çözünürlüklü agaroz jel elektroforezi ile yapılır.

32P DNA tespiti ve DNA merdiveni çözülmesi için poliakrilamid jel elektroforez için radyoaktif dCTP etiketlenmiş kullanabilecektir geleneksel TRAP ile karşılaştırıldığında, bu protokol, fare beyninin telomeraz aktivitesini değerlendirmek yeteneğini göstermek için TRAP tasarruf toksik olmayan bir zaman sunar telomeras farklılıkları tespitÇeşitli dişi ve erkek fare beyin bölgesinde aktiviteye sahiptir.

Introduction

Telomeraz telomeraz bir ribonükleoprotein oluşan ters transkriptaz (TERT), telomeraz katalitik alt birimi, ve bir RNA bileşen (TERC) 'dir. Telomeraz kanonik rolü, bu nedenle genomik bütünlüğü ve hücre proliferasyonunu 1 teşvik telomerik uçlarına tekrar dizileri (TTAGGG) eklenerek telomerlerin uygun uzunluğunun korumaktır. Bu çeşitli zarar verici madde 2 ile uyarılan apoptoza karşı direnç kazandıran, yani başka roller de, hücrelerde TERT atfedilmiştir oksidatif stres 3 insan mezenkimal kök hücrelerini koruyan ve pozitif RNA TIA1 ile olan ilişkisi ile tam olarak farklılaşmış nöronların hayatta kalma yanlısı bir rol oynar granüller 4.

Enzim ekspresyonu ve aktivitesi düzeyleri sıkı Bölünmeyen hücreler 5,6 olarak düzenlenmiş olsa da, TERT, ifade edilen ve daha çok somatik bölünen hücreleri ve kanser tiplerinin çoğunda aktif bir biçimde gösterilmiştir. Çalışmalar r göstermiştirTERT mRNA, erişkin 7 içine daha düşük düzeyde muhafaza edilirken Odent beyin, telomeraz aktivitesi, doğum sonrası 10. günde fark edilemez hale gelecektir. Diğer çalışmalar yetişkin alt-ventriküler bölge, koku ampul, hipokampus içinde telomeraz aktivitesini gösterdi ve yetişkin beyincik ve kortekste 8. , Enjekte edilen fareler SOD1 transjenik amiyotrofik lateral skleroz hastalığının başlamasını ve ilerlemesini yavaşlattığı – Yakın zamanda beyin ve omurilik telomeraz ekspresyonunu ve aktivitesini de artırır yeni bileşikler, N-metil-D-aspartat (NMDA) nöro-koruyucu etkiler üretmiştir göstermiştir fare ve bu farelerin 9 omurilikteki motor nöronların hayatta kalma artmıştır. Tam nöronlarda ve beyinde telomeraz pro survival rolünü anlamak için, beynin farklı bölgelerinde telomeraz aktivitesinin tespit edilmesi için basit, hızlı ve nispeten hassas bir analiz geliştirmek için gereklidir.

Telomerik rEPEAT amplifıkasyon protokolü (TRAP) sıraları düzenlenmiştir telomeraz aktivitesi kanonik ve polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) birleştiren bir iyi bilinen hassas bir deneydir. Bu deneyde, telomeraz TTAGGG telomeraz substrata TH ters primeri kullanılarak 6 baz çifti (bp) DNA merdiveni oluşturur PCR amplifikasyonu takiben (TH astar) oligonükleotid, tekrar ekler -. ACX 32P dCTP etiketli en tespit etmek için kullanılır PCR ürünlerinin, düşük miktarda. DNA merdiveni dizileme poliakrilamid jel elektroforezi (PAGE) ile çözümlenir. Her iki DNA bantların yoğunluğu ve DNA merdiven uzunluğu, aktif enzim moleküllerinin miktarını ve işlem kapasitesi, sırasıyla 10 yansıtmaktadır.

Bu geleneksel tahlil bazı önemli zorluklar tutar: (gecede her iki durumda) sıralama PAGE ve jel çalışan zaman tüketimi ve radyoaktif ürünün filmi pozlama işlemek için büyük ve sert radyoaktif maddelere maruz kalma tehlikesi. </p>

Bu protokol, gelişmiş bir radyoaktif olmayan bir agaroz mini jel bazlı bir deney sağlar. DNA, 6 bp'lik bir basamağı% 4.5 yüksek çözünürlüklü agaroz jel kullanılarak çözümlenir ve algılama son derece hassas bir nükleik asit leke kullanılarak başarılabilir. Agaroz mini yüksek çözünürlük jel ve duyarlı nükleik asit leke kullanılarak kombinasyonu, analizi kullanımı kolay sunar radyoaktiviteye maruz tehlikesini bertaraf eder ve önemli bir kaç saate kadar 3 gün genel deney süresini kısaltır.

Protocol

Hayvan deneyleri Ben-Gurion Üniversitesi'nde (IL-39-08-2010) hayvan deneyleri için etik kurul tarafından onaylandı. 1. Fare Beyin Protein Ekstraksiyonu Her bir buz üzerinde 5 mi Ringer çözeltisi ve yeri içeren tüplerde 15 ml 3 tüpleri hazırlayın. (DİKKAT – kimyasal kaput kullanmak) İsofloran anestezi kullanarak fare Kurban servikal dislokasyon ve hemen dekapitasyon 10-20 sn. Kafatası beyin çıkarın ve beyin dokusunda hasar görmesini önlem…

Representative Results

Tüm hücre protein için 1 ve 3 aylık yaş 3, CD-1 erkek ve 3, CD-1 erkek fareler türetilen, frontal lob (FL), beyin sapı (BS), serebellum (CR) hazırlanmıştır modifiye TRAP tahlil ve radyoaktif TRAP eski 2 aylık yaşta 3 CD-1 erkek fareler. Telomeraz aktivitesi modifiye TRAP deneyi kullanılarak ayıkla 1 mcg proteinler tespit ve 2 mcg proteinler radyoaktif TRAP için ayıklamak edildi. Radyoaktif TRAP ile ve modifiye TRAP ile telomeraz aktivitesinin tespiti 1C genel DNA merdiveni <str…

Discussion

PCR 4 ile telomeraz reaksiyonu 3) telomeraz reaksiyon ürünlerinin amplifikasyonu – beyin dokusu 2) spesifik bölgelerinden 1) proteinlerinin ekstre Telomeraz suretiyle, primer uzaması TS: TRAP ile fare beyin telomeraz aktivitesi analizi 4 ana adımdan oluşur yüksek çözünürlüklü agaroz jel kullanılarak, PCR-ürünlerinin) ayrılması.

DNA merdiveni ve PAGE PCR ürünleri ayırma hassas bir şekilde tespit radyoaktif dCTP 'lerin kullanımı: Bu değiştirilmiş TRAP yönteminin…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work was partially supported by B.G. Negev technology and Linda Powers’s contribution.

Materials

Name of Material/ Equipment Company Catalog Number Comments/Description
TRAP Mix (X10) Made manually, mix the following in UPW: 630mM KCl, 200mM Tris-HCl pH8.2, 10mM EDTA, 15mM MgCl2, 1mg/ml BSA, 0.5% TWEEN (purchased from sigma). Aliquots are freezed  in -20 C.
Ringer's solution Made manually, mix the following in DDW: 124mM NaCl, 3mM KCl, 1.25mM NaH2PO4*H2O, 2mM MgSO4, 26mM NaHCO3, 1.802 g/L D-(+)-glucose anhydrous.
Isoflurane Minrad INC. NDC 60307-110-10 Handle with care in a chemical hood
dNTP's 10 mM Sigma D7295
TS primer (5'-AATCCGTCGAGCAGAGTT-3') Sigma DNA oligos orderd in DRY format and UPW added according to requierd concentration
ACX primer (5'-GCGCGGCTTACCCTTACCCTTACCCTAACC-3') Sigma DNA oligos orderd in DRY format and UPW added according to requierd concentration
Titanium Taq Polymerase/Buffer Clontech S1792/S1793
High Resolution agarose Sigma A4718 Any high quality high-resolution agarose may be sutible
Mini-gel apparatus  Bio-Rad 170-4466
Nucleic-acid Stain (GEL-RED) Biotium 41003
IC primer (5'-ATCGCTTCTCGGCCTTTT-3') Sigma DNA oligos orderd in DRY format and UPW added according to requierd concentration
CHAPS lysis buffer Cell Signaling Technology 9852S Add PMSF (protease inhibitor) to a final concentration of 1mM
Ultra Pure Water (UPW) Biological Industries 01-866-1B
CD-1 mice HARLAN Laboratories INC.

References

  1. Urquidi, V., Tarin, D., Goodison, S. Role of telomerase in cell senescence and oncogenesis. Annu Rev Med. 51, 65-79 (2000).
  2. Cong, Y., Shay, J. W. Actions of human telomerase beyond telomeres. Cell Res. 18, 725-732 (2008).
  3. Tichon, A., et al. Oxidative stress protection by novel telomerase activators in mesenchymal stem cells derived from healthy and diseased individuals. Curr.Mol. Med. 13, 1010-1022 (2013).
  4. Lannilli, F., Zalfa, F., Gartner, A., Bagni, C., Dotti, C. G. Cytoplasmic TERT associates to RNA granules in fully mature neurons: Role in the translational control of the cell cycle inhibitor p15INK4B. PloS one. 8, e66602 (2013).
  5. De Jesus, B. B., Blasco, M. A. Potential of telomerase activation in extending health span and logevity. Curr opinion in Cell Biology. 24, 1-5 (2012).
  6. Blackburn, E., Collins, K. Telomerase: An RNP enzyme synthesizes DNA. Cold Spring Harb Perspect Biol. 3, 1-9 (2011).
  7. Klapper, W., Shin, T., Mattson, M. P. Differential regulation of telomerase activity and TERT expression during brain development in mice. J. Neurosci. Res. 64, 252-260 (2001).
  8. Caporaso, G. L., Lim, D. A., Alvarez-Buylla, A., Chao, M. Telomerase activity in the subventricular zone of adult mice. Mol. Cell Neurosci. 23, 693-702 (2003).
  9. Eitan, E., et al. Novel Telomerase-increasing compound in mouse brain delays the onset of amyotrophic lateral sclerosis. EMBO Mol. Med. 4, 313-329 (2012).
  10. Kim, N. W., Wu, F. Advances in quantification and characterization of telomerase activity by the telomeric repat amplification protocol (TRAP). Nuc. Acid Res. 25, 2595-2597 (1997).

Play Video

Cite This Article
Grin, Y., Admoni, T., Priel, E. Telomerase Activity in the Various Regions of Mouse Brain: Non-Radioactive Telomerase Repeat Amplification Protocol (TRAP) Assay. J. Vis. Exp. (91), e51865, doi:10.3791/51865 (2014).

View Video